西尼罗病毒研究进展

西尼罗病毒研究进展

老败 2004于上海

摘要

1999年夏季西尼罗病毒脑炎在美国的暴发流行引起美国社会和科学界的极大关注，尽管投入大量人力物力加以控制，在随后几年里病毒感染的蔓延却呈愈演愈烈之势，并在2003年达到高峰，当年有9858人被诊断为西尼罗病毒感染，其中2866人出现中枢神经系统侵犯症状，死亡264人。2004年情况有所缓解，截止至10月26日，感染2231人，其中795人出现中枢神经系统侵犯症状，死亡73人。西尼罗病毒脑炎尚未传入我国，但其对我国人民健康和公共卫生系统的潜在威胁与挑战不容忽视。 本文就近几年来对西尼罗病毒的感染、免疫与流行病学方面的研究进展进行综述。

西尼罗病毒（West Nile Virus，WNV）于1937年从乌干达西尼罗地区的一位女性发热患者体内被首次分离而得名。在其后的近三十年里，西尼罗病毒感染导致的以发热为主要症状的传染性疾病 - 西尼罗热在非洲广为流行，但没有引起任何关注，具讽刺意味的是，历史记载中首次西尼罗病毒导致的脑炎并非天灾，而是人祸。1952年，美国纽约的Sloan-Kettering研究所为95位晚期癌症病人注射了西尼罗病毒以寻求其“溶癌”疗效。其结果是9位病人因此感染脑炎。首例自然感染导致的西尼罗病毒脑炎发生于上世纪五十年代的以色列，随后在1962至1963年小规模流行于法国，在其后的三十年中逐渐蔓延至环地中海以至欧洲各国，向东达到印度和中亚地区。其中，较大规模的暴发流行有1996年在罗马尼亚、1999年在俄罗斯和2000年在以色列。这几次暴发都达到患者数百人，死亡数十人的规模。

分子病毒学

西尼罗病毒属于黄病毒科，黄病毒属。目前已知70多种同属病毒，其中约有半数可导致节肢动物传播的人类疾病，广为人知的有黄热病、登革热、日本脑炎等。在传统病毒分类学中，此属病毒被归类于披膜病毒科（Togaviridae），但是，分子病毒学研究表明，此属病毒在基因组、病毒结构、病毒复制机理等方面与披膜病毒都不相同，故于1985年被重新划分为黄病毒科。

西尼罗病毒有着与同属其它黄病毒相似的病毒结构、基因组组织结构和复制机制。其病毒颗粒直径约40 – 60 nm，有宿主来源的脂蛋白包膜，包膜内的病毒核衣壳为对称多面体状，直径约30nm。病毒包膜对维持病毒体结构的稳定性和保护病毒基因组有重要作用，因而病毒很容易被有机溶剂和去污剂灭活。病毒颗粒中包括3种结构蛋白，C（capsid）蛋白，E（envelope）蛋白和M (membrane) 蛋白。

C蛋白通过位于N、C两端的氨基酸与病毒基因组RNA形成核蛋白复合物。其中段具疏水性，易于与细胞中的膜结构发生相互作用而与病毒的组装有关。

E蛋白是一种糖蛋白，是病毒体表面的重要成分，具有血凝活性和中和抗原性。E蛋白有12个完全保守的半胱氨酸残基，可形成6对二硫键。X线晶体衍射实验表明，E蛋白以“头尾相连”的同型二聚体存在于病毒表面。E蛋白被认为是宿主细胞表面受体的配体并介导病毒对细胞的粘附，实验证据表明，当E蛋白中潜在的integrin联结位点“天门冬氨酸-甘氨酸-精氨酸”结构被突变时，病毒进入宿主细胞的能力会被减弱。

M蛋白来源于其前体蛋白prM。当prM的N端，“pr”片段，被宿主来源的蛋白酶切除并释放到胞外后，剩余部分即为成熟M蛋白。M蛋白的具体功能尚不清楚，据推测与病毒的成熟与毒力有关。

西尼罗病毒的遗传信息载体为一条线形正、单链RNA，长度约11kb。病毒基因组RNA在5＇端 有一个I型帽状结构（m7GpppAmp），3＇端缺少聚腺苷酸序列，以CU-OH结尾。病毒基因组RNA可以直接作为mRNA，从一个开放阅读框内翻译出一条长链前体蛋白，在宿主细胞蛋白酶和一种病毒基因编码的丝蛋白酶作用下，长链前体蛋白被切割成至少十种成熟的蛋白，其中包括3种结构蛋白（C、prM 和E蛋白）与7种非结构蛋白。这些蛋白在病毒基因组上的编码顺序为：C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。 病毒的7种非结构蛋白功能尚不完全清楚。目前已知NS1是一种分泌蛋白并强烈激活宿主的体液免疫应答。用纯化的NS1蛋白免疫动物可得到保护性免疫。NS2A、NS2B、NS3、NS4A和NS4B都是疏水性蛋白，据推测，它们有些是蛋白酶或蛋白酶辅助因子。NS3和NS5都是较大的亲水性蛋白。NS3蛋白的N端1/3在氨基酸序列水平类似于一种胰岛素样丝氨酸蛋白酶，其酶活性已被实验证实。NS3蛋白的C端3/4表现RNA螺旋酶活性，被认为与病毒RNA复制有关。与其他非结构蛋白比较，NS5蛋白在各种黄病毒中最为保守并具有两种酶活性，即RNA依赖的RNA合成酶活性和甲基转移酶活性。这两种酶活性在病毒基因组复制过程中都起着重要作用。

黄病毒对宿主细胞的粘附和随后的内吞都是由病毒E蛋白与细胞表面受体的相互作用介导的。然而，目前还没有明确的受体分子被发现。另一种病毒对细胞的粘附方式被称为antibody-dependent enhancement (ADE), 体外研究中发现，亚中和剂量的抗体通过其调理素作用，可以增强病毒对Fc表面受体阳性细胞的粘附。据推测，ADE对病毒的组织嗜向性和致病性都有一定影响。病毒借受体介导的内吞作用以吞噬小体的形式进入细胞后，在吞噬小体内酸性环境的作用下，病毒包膜与吞噬小体膜融合，病毒核衣壳被释放入胞浆。在宿主细胞胞浆内完成前述的蛋白合成后，病毒来源的RNA复制酶开始病毒基因组RNA的复制。病毒RNA的复制主要发生于核周区。首先，以病毒正链RNA为模版合成全长的负链病毒RNA，这一过程在感染后三小时即可发生。随后，负链病毒RNA即可以作为模版合成子代病毒正链RNA。病毒正链、负链RNA的合成是非对称性的，其正链RNA的合成较负链RNA多十倍。子代病毒RNA合成后，于内质网内腔组装新的病毒并由胞吐作用分泌到胞外，完成病毒繁殖周期。

西尼罗病毒可以在多种体外培养体系中生长，包括鸡、鸭胚、各种人、猴、猪、啮齿类动物和昆虫来源的细胞系并导致细胞病变效应。小鼠与豚鼠动物模型对病毒脑内注射感染高度敏感。病毒RNA具感染活性。

感染与免疫

流行病学调查表明，约80%的西尼罗病毒感染者并无症状，另20%以发热为主要症状。其他的常见症状有头痛，极度乏力，恶心、呕吐，皮疹，淋巴结炎。如果没有严重并发症发生，以上症状通常在一星期左右自愈，但乏力症状通常延续更久。中枢神经系统感染多发于老年人，主要为为脑脊膜炎和大脑炎，是西尼罗病毒感染最严重的并发症，常表现为急性的软瘫。值得注意的是，西尼罗病毒中枢神经系统感染在感染人群中的比例似有上升趋势。如前所述，从三十年代病毒被发现到五十年代均无西尼罗病毒自然感染导致脑炎的报道。从五十年代到九十年代末期，出现中枢神经系统症状的患者占西尼罗病毒感染病例总数（出现临床症状者）的1%左右。然而，最近的资料表明，这一比例在2003、2004年美国的流行中已接近三分之一。另一方面，某些其它症状，如皮疹和淋巴结炎的发生率，在近期感染病人中显著减少。这些现象表明病毒的变异在近期的爆发流行中起显著作用。病毒对中枢神经系统的破坏被认为是病毒对神经元的直接侵染与宿主细胞毒性免疫反应共同作用的结果。至于病毒是如何突破血脑屏障的，目前尚无定论，一个假说是病毒可沿轴突逆行侵犯中枢神经系统。另外，已观察到病毒可在血管内皮细胞中复制，是为病毒突破血脑屏障的又一个可能途径。

西尼罗病毒感染没有特异性症状和体征，常规实验室诊断和医学影像学诊断对鉴别诊断亦无重要帮助，确切的诊断只能依赖于血清学诊断和病毒分离。然而，西尼罗病毒与其同属的黄病毒，即日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，墨累谷脑炎病毒，Kunjun病毒共同形成一个血清族，它们之间存在着广泛地抗原-抗体交叉反应，成为准确的血清学诊断的障碍。故此，在诊断工作中除应确保使用病毒特异性抗体外，最好还能使用一系列同属病毒的抗体作为对照。目前，对西尼罗病毒脑炎还没有有效的抗病毒治疗，支持疗法是仅有的治疗手段。其病死率约为10%，而生存下来的病人中多有长期的神经、精神症状后遗症。

前面提到过日本脑炎病毒与西尼罗病毒在生物分类和血清学方面的近似性。并且，多年以前，人们就在豚鼠中观察到过日本脑炎病毒与西尼罗病毒的交叉保护反应。但是，最近的研究表明，由日本脑炎疫苗免疫的志愿者的血清中并无西尼罗病毒中和抗体。迄今为止，只有一种西尼罗病毒灭活疫苗通过应急程序获得批准在动物（马）中使用。数种人用疫苗还处于研发阶段。

流行病学

由于缺乏有效的疫苗和抗病毒药物以预防和治疗西尼罗病毒的感染。因此，了解病毒的传播方式以切断其传播途径成为人类对抗西尼罗病毒感染最主要的手段。与其他致病性黄病毒一样，西尼罗病毒最主要的传播者是蚊子。1999年在美国的研究显示，库蚊是西尼罗病毒的主要携带者。然而，2003年的研究表明西尼罗病毒已经可以从几乎所有的蚊子种属中检出。鸟类是西尼罗病毒最重要的宿主。病毒可在鸟体内大量繁殖并形成高带毒量的病毒血症，这一特征是病毒传播中的关键。值得注意的是，西尼罗病毒对鸟类的毒力仅见于最近在美国的流行。此现象又一次反映了西尼罗病毒近期的变异，其流行病学与生态学影响还有待长期观察。人类与其他哺乳动物被认为是病毒传播路径中的“终端”。在人类，病毒血症仅存在于感染症状出现前后很短(约一、两天)的时期，且血中病毒含量很低，仅约 150pfu/ml，故此，在自然状态下不太有机会将病毒播散出去。然而，特殊状态下人群间西尼罗病毒的传播正在引起越来越广泛的重视。2002年美国发现了23例输血导致的西尼罗病毒感染（来源于16名带毒献血者）。从2003年六月起，美国开始以RT-PCR的方法对所有血制品进行检查，到同年九月中旬，在检查过的二百五十万份血制品中有489份呈西尼罗病毒阳性。尽管如此，在2003年还是发生了两例输血导致的西尼罗病毒感染。器官移植是另一个潜在的西尼罗病毒传播途径。在2002年的一个案例报道中，一位西尼罗病毒带毒者的器官被移植入4个病人的体内，其中的3个病人发生了西尼罗病毒脑炎。西尼罗病毒的母婴传播也是令人忧虑的问题之一，其首例感染亦发生于2002年。已知西尼罗病毒可穿过胎盘屏障导致子宫内胎儿的感染。西尼罗病毒是否可以通过母乳传播尚无定论，是目前研究中的课题之一。

1999年西尼罗病毒脑炎在美国的流行是美洲大陆首次发生的西尼罗病毒自然感染。美国流行病学工作者能够在疾病流行的初期，在仅有数名患者的时候即敏锐地发现了一种未知传染病的暴发，其高超的工作效率和职业技能实在令人赞叹。相形之下，由SARS暴发一案即可看出我国医学、科技工作者在这方面的表现有所欠缺。有鉴于此，笔者愿意在此简要回顾一下1999年西尼罗病毒脑炎在美国的发现过程，希望各位同行从中能够有所借鉴。

1999年8月23日，纽约市皇后区一位内科医生报告了两例疑似中枢神经系统感染病人，几天后，又有两位患者被这位医生发现。传染病人的集中发现引起了公共卫生当局的重视。在同一周内，所有当地医院的病历被复查，共发现8位脑炎患者。这8位患者的共同特征是1.都居住于一个约4英里×4英里的范围内。2. 都为老年人，年龄58 – 87岁。3. 没有发现共同的接触史。4. 亲属中无人患病。5. 发病前都曾参加过夜间户外活动。6. 血清学检查均呈圣路易脑炎病毒阳性。以上证据说明一场圣路易病毒导致的脑炎正在开始流行，已知圣路易脑炎病毒的传播途径为蚊虫叮咬。9月2日，灭蚊行动开始在全城展开。

另一方面，从8月初开始，纽约市的野生鸟类，特别是乌鸦在大量死亡，但无人予以关注。最终，纽约市动物园珍稀鸟类的死亡引发了病原学调查，很快，从死鸟中分离得到了病毒：西尼罗病毒 – 一种从未在美洲自然感染中发现过的病毒。人们立即联想到刚发现的病毒性脑炎病例，上述8位患者的血清立即用抗西尼罗病毒特异抗体再次检测，结果阳性。至此，一场由西尼罗病毒导致的脑炎的暴发流行得以发现。接下来的问题是，西尼罗病毒脑炎是刚刚进入纽约，还是已经不为人知地流行已久？为回答这个问题，对纽约市过去三年中所有脑炎病人的血清标本进行了血清学检查，皆为西尼罗病毒阴性。西尼罗病毒最近入侵美国得以证实。那么，入侵美国的西尼罗病毒是从哪里来的？Lanciotti 等人1999年12月在《Science》上发表的研究论文回答了这个问题。这篇文章中描述的工作质量上乘却并不复杂晦涩。首先，由于西尼罗病毒与数种同属病毒之间存在着抗原交叉性，Lanciotti 等人收集了多种针对黄病毒属不同病毒的特异性单克隆抗体，与不同的黄病毒，包括多种不同来源的西尼罗病毒进行间接免疫荧光抗体交叉试验，以证实流行于纽约的病毒确系西尼罗病毒。其次，Lanciotti 等人比对了多种来源西尼罗病毒的基因序列（一段长1278碱基的prM和E基因）表明了纽约市人、鸟、蚊来源的西尼罗病毒之间的同源性显著高于其他来源的西尼罗病毒，证实了西尼罗病毒在纽约市人、鸟、蚊之间的传播关系。最后，通过对GenBank数据库中40种不同来源西尼罗病毒的进化树分析（比对一段255碱基的E基因）表明了流行于纽约的西尼罗病毒与1998年从以色列分离的西尼罗病毒有着最高的同源性，进而说明流行于纽约的西尼罗病毒来源于以色列。至于病毒是如何从以色列来到美国的则可能成为一个永远无法解开的谜。根据西尼罗病毒传播的流行病学特征，最大的可能性是在全球范围内迁徙的鸟类或搭乘民航班机的蚊子。如前所述，病毒随人类旅客传播的可能性虽不能排除，但机会不大。

美国CDC在鉴定未知传染病暴发流行方面一贯有出色表现，上世纪七十年代发现莱姆病，八十年代发现艾滋病都是很好的例子。尽管无法完全阻止疾病的流行，尽早地发现传染性疾病的爆发、鉴定出病原体无疑对减少人民的生命财产损失有重大意义。

结语

我国目前尚未发现西尼罗病毒感染，是因为病毒尚未传播至我国还是另有原因，其对我国有多大的潜在威胁是一个值得探究的问题。值得注意的是，西尼罗病毒感染不仅未发生于我国，在东亚地区都未见报道，而这一地区正是日本脑炎的流行区域。日本脑炎病毒与西尼罗病毒到底在人类中是否具有交叉保护性？是不是这种交叉保护性使得我国免受西尼罗病毒的侵染, 是一个很有意思的问题。