CRISPR基因编辑MC-3T3细胞系—骨相关研究的神器-源井生物

1981年, 科学家成功从新生小鼠头盖骨中获得了成骨细胞模型--MC-3T3细胞。这种成骨细胞系在体外保持了向成骨细胞分化和矿化的能力，使其成为骨生物学研究中非常有用的细胞模型。MC-3T3能够产生胶原并分化为成骨样细胞，在体外和体内形成钙化组织。早期的研究表明，骨组织通过成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收不断重塑，以维持骨体积和体内平衡。因此，骨重建被认为是由成骨细胞、破骨细胞和骨细胞之间的串扰来调节的。MC-3T3细胞也成为了此类骨相关研究的重要体外模型。

应用：

MC-3T3细胞具有向成骨细胞分化的能力。基于CRISPR/Cas9的MC-3T3细胞基因编辑可以加速骨研究。MC-3T3已经广泛应用于以下几类研究：

1. 型胶原蛋白生物合成，这是细胞外骨基质中最重要和最丰富的有机成分，提供骨骼强度和柔韧性。

2. WNT信号通过调节成骨细胞增殖分化和基质矿化而成为骨形成的重要调节因子。

3. 转化生长因子TGFβ信号转导，骨重建异常，骨转换增加。

4. 成骨细胞分化，一种调控成骨细胞分化的成骨细胞特异性转录因子。功能丧失导致成骨细胞分化和骨形成减少。

CRISPR-U™ 介导的MC-3T3细胞的基因编辑

基因编辑和细胞模型的建立可以促进功能基因组学、信号通路、代谢、细胞死亡、药物发现、药物反应和癌症等领域的研究。目前，成骨细胞模型（MC-3T3）广泛应用于细胞分化、旁分泌因子对骨形成或吸收的影响研究。最近的研究发现，影响骨组织稳态的突变蛋白和新的途径参与骨骼发育和维持。为了加速骨生物学研究，利用CRISPR/Cas9系统可以在MC-3T3细胞中实现基因组编辑。CRISPR-U™是源井生物独立研发的，可用于MC-3T3细胞快速精确基因编辑的系统。通过CRISPR构建的细胞模型使研究各种骨骼疾病的机制成为可能，这些疾病主要与骨骼发育、吸收、骨肉瘤和代谢过程有关。在阐明致病机制的基础上，这些细胞模型可以与药物筛选和其他治疗研究相结合。

案例分析利用CRISPR介导的基因敲除MC-3T3，发现一种预防或逆转骨质疏松症的新途径:

骨质疏松症是一个巨大且日益严重的公共健康问题。骨质疏松症以低骨量和骨微结构缺陷为特征，导致骨折的易感性增加。骨骼健康的维持有赖于骨吸收的破骨细胞和成骨细胞的协调和平衡作用，从而实现骨骼的净平衡。因此，临床上需要寻找新的治疗骨质疏松症的分子靶点，特别是那些在刺激骨形成的同时抑制骨吸收的分子靶点。维甲酸受体相关孤儿受体β（Rorβ）是一种新的成骨细胞分化的负调节因子，在从老年骨质疏松小鼠分离的骨髓源性骨祖细胞中Rorβ的表达高度升高，提示Rorβ在介导年龄相关性骨丢失中的潜在作用。在成骨前小鼠细胞系MC-3T3中的过度表达研究表明，已知的成骨途径有显著的调节作用，支持Rorβ调节成骨的关键作用。研究人员应用CRISPR/Cas9基因编辑技术证明，成骨细胞中Rorβ的丢失增强了Wnt信号传导，特别是通过在Wnt靶基因Tcf7和Opg的启动子中增加β-catenin对T细胞因子/淋巴增强因子（Tcf/Lef）DNA结合位点的招募。因此，通过增加Rorβ缺陷MC-3T3细胞中骨保护素（OPG）的分泌，增加成骨基因的表达并抑制破骨细胞的形成。

CRISPR介导的Rorβ突变体的构建及基因表达分析：

Rorβ基因有两个亚型（Rorβ1和Rorβ2），其中Rorβ2亚型不可检测。因此，Rorβ1是Rorβ基因的代表。Rorβ1的ATG起始密码子位于外显子1的3′端，因此，靶向外显子2进行基因编辑。设计3个gRNA，在测试编辑效率后，选择一个gRNA删除MC-3T3细胞中的Rorβ。用非特异性gRNA产生的对照细胞系MC3T3-Cont。mc3t3drorβ细胞系的克隆和序列分析显示，小鼠Rorβ等位基因存在1碱基对（bp）和4-bp缺失，导致移码突变，最终导致无功能等位基因。为了分析Rorβ缺失对成骨细胞基因表达的影响，从成骨培养基中培养的MC3T3-Cont和MC3T3-DRorβ细胞中采集不同时间点的RNA样本。QPCR分析显示骨标记基因在MC3T3-DRorβ细胞中的表达显著增加。

图1:CRISPR/Cas9在MC3T3-E1前成骨细胞中Rorβ缺失。（A）显示了小鼠Rorβ基因的内含子/外显子结构。（B）用CRISPR/Cas9基因编辑方法对小鼠Rorβ基因第2外显子（大写）进行了突变。用于靶向等位基因的gRNA序列以黄色突出显示。（C-G）两种细胞模型用成骨培养基处理，并在第0-10天（n=6）采集供骨标志物进行qPCR。

Rorβ缺陷成骨细胞通过β-catenin依赖机制显示增强的Wnt信号：

突变的MC3T3-DRorβ细胞被用来识别典型细胞通路的改变。他们观察到Wnt/β-catenin通路的显著改变，以及MC3T3-DRorβ细胞中调节该通路的几种已知的调节因子的表达。IPA分析显示T细胞因子/淋巴增强因子（Tcf/Lef）DNA结合位点显著富集。这些结果表明，成骨细胞中Rorβ的丢失导致Wnt/β-catenin通路的改变。RNAseq证实了两个著名的Wnt靶基因Opg和Tcf7，并观察到该基因在Rorβ缺陷细胞中的表达在整个时间过程中显著上调。Wnt通路在Rorβ缺陷成骨细胞Opg和Tcf7上调中的作用，使用DKK1或JW55进行的一系列抑制剂研究发现Wnt通路因Rorβ的丢失而改变。

图2:Rorβ调节Wnt/βcatenin通路。（A，B）RNAseq和IPA分析鉴定的Wnt/βcatenin调控基因在MC3T3
DRorβ中有显著调控。（C，D）重新查询和分析图1中的时间进程，以获得Opg和Tcf表达式。（E，F）MC3T3-Cont和MC3T3-D
Rorβ细胞系在合流处用成骨培养基处理，然后补充Dkk1（200ng/mL）、JW55（10mM）或两者兼用；48小时后取细胞，并对Opg和Tcf7进行qPCR（n=6）。

Rorβ缺陷细胞通过产生OPG抑制破骨细胞的形成:

对MC3T3-Cont和MC3T3-DRorβ细胞进行芯片检测，以了解β-catenin调控Opg和Tcf7基因的机制。研究人员发现，在Rorβ缺陷细胞中，位于Opg和Tcf7基因启动子内的Tcf/Lef
DNA结合位点的β-catenin和RNA聚合酶（RNAP）募集增加。他们验证了Rorβ抑制了TOP-FLASH
Wnt报告结构中组成活性形式β-catenin（ca-βcat）的转录活性。因此，他们得出结论，Rorβ通过抑制成骨细胞Wnt反应基因启动子中Tcf/Lef结合位点的β-catenin募集来抑制Wnt活性。他们评估了OPG增加对破骨细胞生成的影响。他们发现Rorβ缺陷细胞能够通过增加OPG的产生和分泌来抑制破骨细胞的生成。

图3:Rorβ-缺失增强了β-catenin向Wnt反应基因启动子的募集。（A–D）在用10
ng/mL
Wnt3a或未经处理（基础）6小时后，对MC3T3 Cont和MC3T3
DRorβ细胞系进行芯片分析。对Opg和Tcf7基因启动子中的β-catenin、RNAP和QPCR进行IPs检测。这些数据是与IgG阴性对照IP相关的。（E）Ca-βcat和TOP-FLASH共转染-/+Rorβ，48小时后测定荧光素酶活性（n=6）。（F）收集处理细胞的CM，ELISA法测定OPG蛋白水平。（G）骨髓源性破骨细胞前体与含1%培养基的破骨细胞支持培养基孵育。

综上，Rorβ缺失对骨保护作用在骨微环境中引发多方面的反应。Rorβ的缺失通过增加Tcf7和Wnt信号反应来促进骨形成。同时，Rorβ缺失通过增加OPG的产生和分泌来影响骨吸收，从而减少破骨细胞数量和破骨细胞活性。总的来说，增加骨形成和减少骨吸收是预防骨丢失的结果。抑制Rorβ可能是防治骨质疏松症的新途径。

CRISPR-U™ 高效修饰MC-3T3细胞系基因

CRISPR-U™

是源井生物自主研发的细胞系基因编辑技术。通过对基因编辑载体和过程的优化，提高了CRISPR-U基因切割、重组的效率，是传统基因编辑的十倍。我们可以根据您的需求定制基因编辑MC-3T3细胞系，满足基因编辑的各种需求。为您提供基于敲除、敲除和点突变的MC-3T3模型细胞，助力骨生物学相关的研究。

References:

1.
Osteoprotection Through the Deletion of the Transcription Factor Rorb
in Mice. Journal of Bone and Mineral Research, 33(4) 2018, 720–731.

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