干货丨HEK293细胞培养与基因编辑技巧指南

作为科研领域的“明星细胞系”，HEK293细胞在高通量文库筛选、病毒制备、重组蛋白表达等多种实验场景中应用广泛。其转染效率高、表达稳定、培养体系成熟等优势，使其成为多个研究平台的优选工具。然而，想要在具体项目中充分发挥HEK293细胞的作用，确保实验稳定高效，就必须注重每一个操作环节的规范与细节。本文将从细胞复苏、传代培养、冻存保存，到转染实验及单克隆筛选铺板，全面介绍HEK293细胞的关键操作技术与注意事项，助力科研进程更加顺利！

细胞信息

细胞名称：HEK293（人胚肾细胞）

细胞形态：上皮细胞样，贴壁细胞

细胞培养条件：90%DMEM+10%FBS

气相：空气，95%；二氧化碳，5%

温度：37℃

换液频次：2-3天/次

传代比例：1:3-1:6

细胞生长正常图片：细胞呈不规则多边形或梭形，边缘清晰，类似"铺路石"样排列，细胞边界清晰，单层生长不重叠。

细胞生长状态差图片：细胞形态会发生改变，细胞边缘模糊，拉长、纤维化，边缘模糊、伪足增多，出现空泡或颗粒。

细胞复苏

1. 准备：取7mL完全培养基于离心管中备用

2. 解冻：将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴

3. 离心：将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液

4. 重悬与接种：用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中

5. 培养：将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况

细胞传代（以T25瓶为例）

1. 当细胞汇合度达到80-90%时可进行传代，传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次

2. 加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育 1-2分钟，待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化

3. 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化，然后转移至15mL离心管中

4. 1100 rpm 室温离心 4 分钟，离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞

5. 细胞按照1:3-1:6比例传代，传代第二天观察细胞状态

细胞冻存

1. 收集细胞：按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中

2. 离心：1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清

3. 重悬与冻存：用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息

4. 降温与储存：将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存

细胞培养注意事项

· 培养基和血清：确保使用正确的基础培养基和加入适量血清，配好的完全培养基需4℃保存，建议2周内使用完毕

· 确保细胞培养环境正常

· 操作前需预热培养基和胰酶至37℃，避免温度应激

· 传代时机： 汇合度 80-90% 时传代，通常每2-3天传代一次

· 细胞传代操作：注意消化时间和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤；避免过度吹打而造成细胞膜的损伤；贴壁不均匀时可轻摇培养瓶使细胞分布均匀

· 细胞不贴壁：检查血清质量；使用包被过的培养器皿；改用含EDTA的0.05%胰酶（如TrypLE™），消化时间缩短至30-60秒

细胞转染关键注意事项

1.细胞状态要求：转染前应确保细胞处于对数生长期（汇合度70%-80%），且活率高于95%（可通过台盼蓝染色法检测）。

2.温和消化：消化细胞时需严格控制时间，避免过度消化导致细胞损伤。

3.充分重悬：操作过程中应将细胞吹打成单细胞悬液，尽量减少细胞团块，以提高转染一致性。

4.试剂混匀：使用转染试剂前须充分涡旋或混匀，确保试剂成分均匀分布。

5.预实验筛选：建议提前进行药物筛选预实验，确定最佳筛选浓度，为转染后筛选做好准备。

6.电转法

电转细胞数量应适中，转染后按合适密度接种于相应培养器皿。

电转前需使用PBS清洗细胞1-2次，彻底去除血清残留，防止离子干扰电转效率。

可通过预实验优化电转电压、波宽等参数。

电转后细胞贴壁率应不低于70%。

严格控制电转操作时间，避免全过程耗时过长影响细胞存活。

7.慢病毒法

正式实验前应预实验确定最佳感染复数（MOI）。

感染时细胞汇合度建议维持在30%-40%，不宜过高。

感染前加入助染剂Polybrene以提高感染效率。

感染24小时后须进行了换液操作。

病毒液应避免反复冻融，以维持病毒活性。

8.脂质体法

应选择适配HEK293细胞的脂质体转染试剂，并通过预实验优化转染条件。

建议提前24小时铺板，使转染时细胞密度处于60%-70%。

配制复合物时，应先使用Opti-MEM稀释DNA，再加入脂质体试剂（反向混合可能导致转染失败）。

稀释后室温静置15-20分钟形成复合物（时间过短复合不充分，过长则毒性增加）。

添加复合物时应沿孔板边缘缓慢逐滴加入，轻轻摇匀，避免直接吹打细胞。

铺单克隆实验注意事项

· 使用对数生长期的细胞进行铺克隆，铺克隆前细胞汇合度建议控制在70%左右

· 铺克隆时细胞活率≥90%

· 提前预温所有试剂（包括培养基、胰酶、PBS）

· 建议使用温和消化试剂（如TrypLE Express）

· 可先进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低

· 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀；外围96孔加入PBS防止蒸发

· 使用“梯度稀释法”进行铺克隆，稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间

电转法感染图

慢病毒感染图