用CRISPR技术研究点突变：构建遗传病模型的新策略

随着精准医学的发展，点突变已成为揭示遗传疾病机制和开发个性化疗法的关键靶点。通过如CRISPR/Cas9这类先进的基因编辑工具，科学家得以在细胞与动物模型中准确引入单个碱基的改变，从而深入解析疾病的分子基础，并推动精准治疗策略的研发。

什么是点突变？

点突变指DNA序列中单个碱基的改变（包括替换、插入或缺失一个碱基）。这类突变可能发生在蛋白编码区（外显子）或非编码区（如启动子、增强子、内含子等调控区域），并按功能影响可分为功能丧失型与功能获得型。

1. 编码区点突变：位于基因外显子，分为同义突变（蛋白质序列不变）和非同义突变（改变氨基酸，引发结构或功能变化）。

2. 非编码区点突变：位于启动子、增强子、剪接位点或UTR等区域，不改变蛋白序列，但可能影响基因表达水平、RNA剪接或调控元件功能。

3. 功能丧失突变：基因产物失活或截短，如产生无义密码子导致蛋白功能丧失。此类突变多为隐性遗传（需双等位基因突变才能致病）。

4. 功能获得突变：突变使基因获得新功能或过度活化，常见于显性疾病或癌症基因，如原癌基因突变让细胞持续增殖。

图1. 点突变对蛋白质影响的分类示意图。左侧同义突变不改变氨基酸（Lys→Lys），右侧包括无义突变（产生终止密码子Tag，截短蛋白）和错义突变（AA→Arg/Thr，改变氨基酸）。红字为突变碱基，蓝色和绿色框为氨基酸结构示意。

二、利用CRISPR/Cas9技术实现精准点突变

CRISPR/Cas9系统利用导向RNA（sgRNA）精确识别靶DNA序列，并由Cas9核酸酶引发双链断裂（DSB）。细胞随后通过内源性修复机制修复断裂，有两种主要途径：

非同源末端连接（NHEJ）：修复过程中易引入随机插入或缺失（indel），可导致基因失活。

同源重组修复（HDR）：在提供含特定位点突变的供体DNA模板时，细胞可将目标突变精确整合进基因组中。

通过这种方式，可构建特定点突变细胞（株）系或动物模型，为模拟人类疾病提供理想平台。

三、点突变模型构建流程

典型的构建流程包括：

1.设计靶向突变位点的sgRNA与Cas9系统；

2.合成含目标突变的供体DNA（如单链寡核苷酸）；

3.通过电转或病毒载体导入细胞；

4.采用单细胞克隆技术筛选出含突变的细胞株；

5.对杂合或纯合突变型进行功能验证。

针对显性疾病，仅需要单等位基因突变即可模拟表型；而隐性疾病则需筛选出双等位基因突变型。

图2：CRISPR/Cas9介导的基因编辑示意图。Cas9蛋白（黄色）在sgRNA引导下识别蓝色的靶序列并切割DNA造成双链断裂（DSB）。细胞启动修复机制，非同源末端连接（NHEJ）常引入小插入/缺失（indel）导致基因敲除（左），而同源重组（HDR）则利用提供的供体DNA（黄色片段）精确修复并插入特定突变（右）

四、疾病模型案例分析

1. 中心核肌病（CNM）——杂合突变

常染色体显性CNM常由DNM2基因的单点突变（如R465W）引起。Rabbi等人在患者来源的成肌母细胞和小鼠模型中设计了只识别突变等位基因的sgRNA/Cas9体系，成功靶向并敲除了突变的DNM2等位基因。编辑后，原本异常的细胞膜转运和自噬等功能恢复正常。这说明CRISPR/Cas9可以对显性突变等位基因进行等位特异性编辑，从而逆转疾病细胞的表型，为显性点突变疾病的治疗和研究提供了可能。

2. 阿尔茨海默病（AD，杂合突变）：

家族性早发AD常由APP或PSEN基因的点突变引发，如瑞典突变（APP KM670/671NL）或PSEN1

M146L突变。研究人员利用CRISPR/Cas9设计了特异性gRNA，只破坏突变等位基因。在携带瑞典突变的患者成纤维细胞中，敲除突变的APP等位基因使培养上清中Aβ肽的水平降低约。类似地，在携带PSEN1

M146L异源突变的细胞中进行基因编辑后，原本升高的Aβ42/40比例显著下降并部分恢复正常。这些结果表明，针对AD相关点突变的CRISPR编辑可减轻致病性表型，为阿尔茨海默病机制研究和治疗探索提供新思路。

3. Tay-Sachs病（TSD，纯合突变）：

TSD是一种常染色体隐性遗传的神经变性病，80%的患者携带HEXA基因第11外显子四碱基（TATC）插入突变nature.com。在小鼠中敲除HEXA基因并未能重现典型病理，为此Qian等人尝试使用基因编辑技术构建TSD模型。他们最终采用了新一代引物编辑技术在兔子HEXA基因中插入TATC突变，成功获得了携带该插入突变的兔模型，并观察到了肌无力、共济失调等与人类TSD相似的表型。这一实例说明，通过精准编辑将人类致病点突变导入动物模型中，可在体内重现相应遗传病表型，为深入研究疾病机制提供了工具。

4. 囊性纤维化（CF，纯合突变）：

CF是因CFTR基因隐性突变导致的致死性遗传病，ΔF508等点突变会使CFTR蛋白功能丧失。Fan等人在绵羊中应用CRISPR/Cas9和体细胞核移植技术，敲除了绵羊CFTR基因。他们成功获得了CFTR^–/–和CFTR^+/–的绵羊，出生后CFTR^–/–绵羊出现胰腺纤维化、肠梗阻、输精管缺失等与人类CF高度一致的病理表现。这一大型动物模型展示了CFTR基因缺失足以诱发典型CF表型，验证了该模型用于测试新药和基因疗法的潜力。

五、点突变模型的研究与临床意义

构建携带点突变的疾病模型，不仅有助于深入解析致病突变对基因功能的具体影响，还可用于筛选潜在的基因修复策略或药物干预方式。例如，CF绵羊和TSD兔模型已在多项研究中用于评估针对特定突变的治疗反应，展现了这类模型在推动基础研究和药物筛选中的关键作用。

随着CRISPR等技术工具的不断完善，科学家能以更高精度模拟特定基因型，推动从机制研究到个性化治疗的飞跃。点突变模型，正在成为精准医学的重要驱动力。