骨髓间充质干细胞三系诱导分化技术

骨髓间充质干细胞成脂诱导分化

1.1 接种干细胞

取对数生长期的细胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的细胞密度接种至培养器皿，于37°C,5% CO²培养环境下培养至汇合度90~100%，弃掉上清，加入成脂诱导分化培养基诱导液。NOTE:如细胞贴壁性较差，建议使用0.1%明胶对培养底面进行包被。

1.2 细胞分化诱导

于37°C, 5% CO²培养环境下培养约3天，更换为成脂诱导分化培养基维持液，培养1天后，再更换为成脂诱导分化培养基诱导液，继续培养3天。按照以上换液频率诱导14~21天,并注意观察细胞形态变化。根据细胞诱导形成的脂滴数量和大小，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

2. 染色鉴定

2.1 细胞固定

吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次,弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面,室温固定30~60min,弃去固定液再使用1xPBS清洗两次。

2.2 油红0染色

取生理盐水或1xPBS与油红O原液配制油红0工作液(油红0原液:生理盐水=3:2)，现用现配。配制后可对油红0工作液进行离心，以沉淀染色液中的过饱和析出物。向清洗干净的诱导孔内加入适量油红0工作液,静置染色30min。吸走油红0工作液，用1xPBS清洗两次，并加入适量1xPBS避免细胞干燥。

2.3 诱导评估

显微镜下观察成脂染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，脂滴与油红0染料结合后呈现红色或橘红色。NOTE:干细胞的成脂分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。

骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化 (平面诱导)

1. 细胞分化诱导

将对数生长期的细胞消化下来计数，成软骨诱导分化培养基诱导液重悬细胞，离心后调整细胞密度密度1.0~2.0x 10e7cells/mL。吸取20 μl细胞悬液(约2.0~4.0x 10e5个细胞)悬滴至24孔板中央。置于37°C， 5% CO²培养环境下培养2~3 h使细胞贴壁。2~3 h后补充1 mL成软骨诱导分化培养基诱导液正常培养。每隔2~3天换液一次。按照以上换液频率诱导21~28天，并注意观察细胞形态变化。

2. 染色鉴定

2.1 细胞固定

吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次,弃去.后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30~60min后，弃去固定液再使用1xPBS清洗两次。

2.2 阿利辛蓝染色

向清洗干净的诱导孔内加入适量染色液，避光静置染色30min。吸去阿利辛蓝染色液，用1xPBS清洗两次,并加入适量1xPBS避免细胞干燥。

2.3 诱导评估

显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。

成软骨诱导分化操作(三维诱导)

1. 干细胞的准备

将对数生长期的细胞消化下来计数，取3x 10e5个细胞转移到15mL离心管中，250g离心4 min。弃上清,加入0.5 mL成软骨诱导分化培养基预混液，重悬细胞，150g 离心5min。小心弃去.上清，加入0.5 mL成软骨诱导分化培养基诱导.液，重悬细胞，150 g离心5 min。将15 mL离心管的管盖稍稍旋开，放置于37°C，5% CO²培养环境下培养。

2. 细胞分化诱导

24h后观察细胞沉淀形变团聚的情况，如有明显的变化，则小心轻柔地拨动管底，尝试让细胞团脱离管底，全部浸润在诱导液中。

置于37°C, 5% CO²培养环境下培养约21天，通常每2天更换一次新鲜配制的成软骨诱导分化培养基诱导液。注意观察细胞团成球情况及表面光滑度，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

3. 染色鉴定

3.1 软骨球固定

将软骨球从离心管中转移至EP管,并使用1xPBS清洗两次，最后置于适量的4%中性甲醛溶液中。

3.2 石蜡包埋切片

软骨球经石蜡包埋后切片。

3.3 阿利辛蓝染色

将石蜡切片脱蜡和脱水，使用阿利辛蓝染色液染色30 min，用自来水冲洗2 min,蒸馏水冲洗1次。

3.4 诱导评估

显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。

NOTE:干细胞的成软骨分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异

骨髓间充质干细胞成骨诱导分化

1.1 明胶包被培养器皿

干细胞培养较长时间后，可能会出现脱壁卷边或漂浮现象，建议使用0.1%明胶溶液对培养器皿进行包被。准备合适的培养器皿，取适量明胶覆盖底面37°C静置30 min,吸取晾干即可使用。

1.2 接种干细胞

取对数生长期的细胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的细胞密度接种至包被后的培养器皿中,于37°C，5% CO²培养环境下培养至汇合度60~70%，弃掉上清，加入成骨诱导分化培养基。

1.3 细胞分化诱导

于37°C, 5% CO²培养环境下培养约14~21天，每2~3天换液一次，并注意观察细胞形态变化。根据细胞钙盐结晶析出和钙质结节形成的情况,决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

2. 染色鉴定

2.1 细胞固定

吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次，弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30~ 60 min,弃去固定液再使用1xPBS清洗两次。

2.2 茜素红染色

加入适量茜素红染色液染3~5 min,吸走茜素红染色液，用1xPBS清洗两次，并加入适量1xPBS避免细胞干燥。

2.3 诱导评估

显微镜下观察成骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，钙质结节与茜素红染料结合后呈现红色或橘红色。

NOTE:干细胞的成骨分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。