基因敲除不成功？可能是忽略了单克隆这一步

一、为什么要考虑单克隆化？

使用
CRISPR/Cas9 技术进行基因敲除，在完成转染或转导、富集筛选之后，往往会得到一个细胞群体（Cell
Pool），其中包含了纯合敲除（homozygous
KO）、杂合突变（heterozygous）以及未编辑（wild-type）细胞。此时，研究者面临一个关键判断：是否必须从这个混合群体中进一步筛选单细胞克隆（single-cell clone），以获得基因型和表型都高度均一的敲除细胞系？

从文献来看，若敲除效率极高（例如多数细胞都为功能失活突变），那么立即使用敲除池进行初步功能验证是可行且时间成本低的选择。但如果研究目标强调长期、稳定、可重复的纯合敲除模型（如蛋白功能验证、细胞信号通路研究、药物响应模型构建等），那么单克隆分离便成为保障数据可靠性的必要步骤。

原因包括：

1. 若敲除池中仍有未编辑或杂合细胞残留，这些细胞可能表达目标蛋白，从而掩盖敲除细胞的真实表型，导致结果波动或误判。

2. 许多常用细胞系存在多拷贝（例如三拷贝、四拷贝）目标基因的情况，如果不是每个等位基因都被敲除，残留表达风险更高。选择单克隆能够确保每个等位基因均被编辑，从而提升纯合KO成功率。

3. 外显子跳跃或可变剪接（exon skipping/alternative splicing）可能导致虽然一个外显子被破坏，但仍有功能残余蛋白表达。单克隆可以筛出真正失活的克隆，提高数据一致性。例如，一项研究指出：不同单克隆之间即便目标相同，也会有显著的转录和表型差异，提示“克隆前背景异质性”本身就是实验误差源之一。

本着研究可靠性优先原则，如果项目对可靠重复性和纯合敲除有高要求，单克隆化不仅是推荐，更是必要。相反，在早期高通量筛选、快速功能提示或资源受限的情形下，敲除池（KO pool）可作为速效起手选择。

二、 高效实现单克隆筛选的实用策略

为了最大化效率、降低失败概率，下面是高效进行单克隆筛选的推荐流程：

1. /转导后/转导后细胞群体富集：完成载体递送后，进行抗性筛选或荧光报告筛选，收获编辑富集群体。

2. 单细胞克隆分离：

l 有限稀释法（Limiting Dilution Cloning, LDC）：将细胞稀释至每孔约 0.5–1 个细胞，接种96孔板多块。若目标为每孔约0.8 细胞，可将悬液设为8 cells/mL，每孔100 µL。低密度培养可降低克隆间干扰，但部分难存活细胞系可能需要改善生长条件。

l 流式细胞单细胞分选（FACS）：使用活细胞筛选（如 PI 排除死细胞）后，分配单个细胞至每孔培养。可结合GFP报告或抗体标记选择编辑阳性细胞，提高单克隆效率。

3. 克隆培养与初筛：单细胞获得后培养2–3 周直到可见克隆，记录孔位、编号，并维持低代次传代以防漂移。

4. 基因型/表型初筛：从每克隆提取基因组DNA，进行PCR扩增、Sanger测序或T7E1酶切评估突变情况（indel率、是否纯合）。

5. 功能验证：对候选克隆进行蛋白检测（Western blot、免疫荧光）以及功能性表型检测，确认敲除效果符合预期。

6. 细胞库建立与长期维护：对成功克隆进行低代次冻存、记录 STR 鉴定及支原体检测，建立备用库防止克隆漂移或污染。

通过上述有序流程，结合精确记录与多克隆并行验证，可显著提高单克隆敲除细胞系构建的成功率与可重复性。

三、 总结

在基因敲除研究中，是否进行单克隆分离应基于您的研究目标：如果目标为快速初步功能验证，则高效的敲除池可能已足够；但若追求研究结果的可重复性、纯合性与长期稳定性，单克隆化就是关键环节。采用优化流程（如稀释、分选、并行多克隆验证）加上合适的引物设计策略，可显著提升敲除细胞系的质量和可靠性。此外，建议在敲除实验之前就考虑控制克隆背景和验证多个克隆，从而减少“克隆效应”所带来的变异风险。

四、 源井生物助力一站式敲除细胞系构建

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参考文献

Craft,
J., Truong, T., Penn, B. H. High-Efficiency Gene Disruption in Primary
Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA
Complexes. J. Vis. Exp. (198), e65264, doi:10.3791/65264 (2023).