CRISPR文库构建，如何摸索合适的MOI?

CRISPR文库构建中，摸索MOI(Multiplicity
of
Infection，感染复数)是一个关键步骤，直接影响文库的覆盖度、感染效率和细胞健康状态。通常CRISPR文库一般选择病毒感染效率为30%左右的MOI，以确保每个细胞平均只被一个病毒颗粒感染，避免多个ERNA整合到同一细胞中。

实验步骤:

1.细胞准备: 选择生长良好处于对数生长期的细胞。

2.设置MOI摸索梯度: 设置一系列不同的MOI值进行摸索。通常可以从较低的MOI值开始，逐步增加至较高的MOI值。

3.铺板: 将细胞按一定的细胞量接种到96孔板中，感染时细胞汇合度在30%-50%之间。

4.病毒感染: 按照MOI梯度,分别加入不同的病毒液。病毒量计算公式:。感染时需要添加助染剂0.5mg/mlpolybrene。

5.筛选: 如果病毒携带抗性基因(如Puromycin)在感染48小时后加入筛选药物。细胞持续筛选至空白组细胞死亡，此时检测细胞的感觉概率。

6.检测感染效率:

①英光显微镜观察:如果病毒携带荧光标记(如GFP)，可直接通过荧光显微镜观察感染效率。

②流式细胞术:对荧光标记的细胞进行流式分析，定量计算感染效率。

③qPCR检测:提取细胞基因组DNA，通过qPCR检测病毒整合情况。

④CCK-8法:通过CCK-8法检测病毒感染对细胞活力的影响，从而间接反映病毒感染的效果，从而帮助摸索出适宜的MOI范围。

注意：若使用①、②、③这三种方式检测感染效率是不需要通过药筛之后再计算感染效率的，可在感染后一定时间(如24小时48小时、72小时等)直接检测感染效率。

7.MOI选择

数据处理后选择感染效率在30%的MOI值作为正式实验感染的MOI注意事项：

①细胞密度: 在病毒感染前，确保细胞密度适中，避免细胞过密或过疏影响病毒感染效率。

②感染时间: 感染时间不宜过长或过短，应根据病毒类型和细胞特性进行优化。

③感染试剂: 选择合适的感染试剂和感染条件，以提高病毒感染效率。

CRISPR文库构建，MOI的选择很重要。以上是小编分享的注意要点，希望能帮助到大家哦，如有其他的产品或者技术问题咨询，请联系我们哦！