在花园的堆肥里，我学到了博士生涯中的最重要一课

在德国小镇普伦的一处花园里，一桶堆肥成了一位新博士生研究的起点。从最初的偶然发现，到对机制的执着追问，他很快便直面自然体系的高度复杂性，对实验证明无从下手。通过调整思路、反复实验，他最终迎来了属于自己的 Eureka 时刻。在看似繁琐而枯燥的实验中积累经验，他也学会了如何与研究中的“黑箱”相处。这不仅是一项研究的完成，更是一段科研方法与心态的历练——在平凡的研究中，学生得以成长。

撰文 | 赵彦淞（Max Planck Institute for Evolutionary Biology）

2021年8月底，我来到德国北部群湖环绕的小镇普伦（Plön），在那里的马克斯·普朗克进化生物学研究所（Max Planck Institute for Evolutionary Biology）开始博士研究，课题是复杂微生物群落里的水平基因转移（即DNA片段在不同的微生物个体之间的交换）。我的导师Paul Rainey是一位功成名就的进化生物学家，当时的研究兴趣已逐步转向到从哲学层面解释和应用进化理论（如个体性的进化转变、人类和人工智能的共进化等），但仍始终保持着生物学家从经验主义的实验中归纳推理的思路，研究水平基因转移便是希望借此理解微生物群落在功能层面的进化规律。

实施这些实验必然要选择一个“模式群落”，恰好，Paul对回归田园情有独钟，在房子附近开垦了很大一片花园，定期把枯枝烂叶捡到一个大垃圾桶里做堆肥，于是我们就决定研究这个堆肥里的微生物群落。那年9月底的一个阳光明媚的周日，我第一次到Paul的院子里采集堆肥样品，从此开始了对这个堆肥数以年计的探索。

简化设计

在读博起初的一年里，我们把这个堆肥当作一个整体来研究，在实验室不同条件下养堆肥群落，进行测序和生信分析。在几年前，Paul为了追踪不同群落之间的基因转移，设计并实施过一个大型的实验：收集不同来源的堆肥样品，分别培养形成独立的群落，然后定期交换它们的滤液（滤液里没有细菌或真菌，但可能有病毒和质粒等），每次交换后再对其进行宏基因组测序。这样一来，如果某个群落里突然出现了一段新序列，而这段序列恰好能从之前时间点的其他群落中找到，那么这段序列很可能就是通过滤液在群落间发生了转移。我按照设计实施了实验，但初步结果并不理想——出现了太多假阳性序列，大部分应该是由于宏基因组测序深度不足所致。而这些堆肥群落本身极为复杂，我的生信分析水平也非常有限，一时间项目推进举步维艰。

意识到这种大型实验太野心勃勃，我开始思考如何简化设计。原方案本质上是追踪不同群落之间的基因交换，那要是去研究一个群落和某个特定菌株的基因交换，岂不是等于减少掉了一个维度？

恰好，我们实验室在过去几十年来建立起的模式菌株——假单胞荧光杆菌SBW25——起初就是从植物根系中分离的，理论上可以适应花园堆肥环境。于是，我就在实验室里对SBW25菌进行连续传代，并在每次传代时向培养液里加一些堆肥滤液。得到十几代之后，我将菌液铺板，挑取单菌落，再对这些菌落重新进行测序，看它们有没有从滤液中获取新的基因片段。

在此，我必须感谢Paul答应了我测序的请求。后来我得知，他当时觉得这基本是天方夜谭，“当我们开始用花园堆肥进行培养实验时，我以为我们可能永远也找不到任何新基因片段。堆肥太复杂了，细菌捕获这些片段的概率太低了。”但无论如何，他出资让我测了几十个菌落，几周后拿回原始数据，分析时我也并未抱太大希望。出乎我们所有人意料的是，在其中一个菌落中，真的组装出了一段55 kb的陌生序列（我们把它叫作I55）！这个意外之喜是我博士阶段最核心的发现，但我当时远未意识到它的意义。不然的话，我也不会只依稀记得这发生在2022年11月底，而说不清具体是哪一天了。

探寻机制

我所在的实验室名为“微生物种群生物学实验室”，主要关注种群动态及其成因，所以发现I55后，自然而然提出的第一个问题就是：为什么它会以足够的频率被小范围抽样捕获到？有两个可能的假设。首先说第一种：I55极大提升了宿主细菌的存活和繁殖能力，也就是被自然选择青睐，从而在连续传代中占比不断上升。要验证这个假设，需要做适应度实验，即比较不同细菌在同一环境中的扩增能力，而这正是我们实验室的看家本领。利用流式细胞仪进行适应度实验，我们很快就肯定了假设的正确性。后续通过噬菌体分离和连续敲除实验，我们确认了I55在堆肥滤液里的高适应度是源于其序列上的二型限制-修饰系统对滤液中一个烈性噬菌体的抗性。我们对锁定有效基因这一步投入了比较大的精力（感谢帮助我的技术员Christina Vasileiou），但从本质上说，这一步属于经典的还原论方式，而最终锁定的有效系统也早已被研究得非常透彻。从探索潜力上讲，这个发现略为平凡，但这就是清晰的事实——it is what it is。

我个人更感兴趣的其实是第二种假设，且这个假设是与第一种并行不悖的。在上述机制中，I55随着宿主细菌的繁殖而复制，但它或许还能自主复制，并在不同细菌间扩散传播？要检验这个假设，本质上是测试I55能否在不同SBW25菌株之间移动。为此，我们在I55上插入了一段抗生素抗性标签，并将其与野生型菌混合，看标签能否跨细胞转移。实验结果是我们最期待的版本——I55确实能在细菌间传播，但当且仅当环境中存在堆肥滤液时。这个结果其实已经回答了种群动态方面的问题，即它为何能在传代中迅速扩散。不过，出于最自然的好奇心，还有一个问题不容忽视：这段序列的转移机制是什么？

通过一系列针对性实验，我们基本排除了共轭（即通过细菌间的物理连接传递DNA片段）和转化（即细菌从环境中吸收游离的DNA片段）的可能性，一切证据都暗示I55的移动是依赖滤液中某些成分的协助，极有可能是某些噬菌体。此前验证第一个假设时，我们已从滤液里分离出了很多噬菌体株，现在需要逐一尝试它们能否导致I55的转移。然而令人沮丧的是，结果都是阴性的。

尽管没能搞清楚转移机制，但群体层面的两个假设都得到了验证，加之重复进行的捕获实验以及生信分析（与同所的马越博士合作）都发现了很多类似I55的序列，我们此时就觉得故事已经完整，便将这些发现写成了论文。我的导师对商业性学术出版社的高收费和剥削行为很反感，因此近年来的工作只投给非营利性的学会期刊，又因为我们自认为这项工作尚未阐明分子机制，显然达不到《科学》（Science）期刊的标准，于是就把手稿投给了《美国科学院院刊》（PNAS）。论文送审后被拒，审稿意见在意料之中——锁定协助I55转移的介质将极大提升工作深度。但这究竟是一项艰巨的任务——易于从堆肥中分离出的噬菌体都证明不能协助转移，那么还能从何处着手搜寻有效介质呢？悲观地想，I55的转移或许依赖的是无法分离的噬菌体，甚至可能不仅依赖一种噬菌体，而是几种噬菌体加特定小分子物质……自然可以如此复杂，复杂到我们穷尽一生都无法验证所有的排列组合。

从还原到整体——Eureka时刻

但凡事都有两面，既然我们无法改变自然的复杂，何不接受它，并把这种复杂化为己用？之前的思路都是先从滤液中纯化成分，再检验其有效性，这种自下而上的穷举，终究敌不过无尽的组合。但若换一个角度，将滤液视为一个整体，通过自上而下的操作干扰、简化它，或许能最大化提取关于转移介质的信息。从还原论转向整体论，在导师Paul的鼓励下，我重新开始了对这转移介质的搜寻，并在完全未知它的类群，甚至不知其是否算得上生命的情况下，逐步掌握了它的一些特性。例如，它在滤液中的浓度大概是每毫升105个，且被稀释后，只要与SBW25菌共培养一轮，就总能恢复到这个浓度。

这些扎实而繁复的实验中积累的经验，让我开始习惯于研究黑箱中的对象，并指引我最终锁定了这个介质的真正身份。核心实验的思路是再基础不过的“稀释至灭绝”，也就是将能介导I55转移的堆肥滤液沿着梯度不断稀释。由于此前已经确认有效介质在经过一轮扩增后总能恢复到固定的浓度，因此沿着稀释梯度的滤液经扩增会分成清晰的两类：高于某个浓度阈值，有效介质仍存在并能被扩增，从而能介导I55转移；低于这个阈值，有效介质被稀释掉，也就无法介导转移。若是将这个阈值两侧的滤液进行深度测序，那么那些存在且仅存在于能介导I55转移的样品中的序列，就几乎一定是有效介质的序列（或至少与它相关）。

等待测序结果返回的时光无比漫长，直到2025年2月7日——我永远也忘不了那个冬日的傍晚——一段超过250 kb的长序列赫然出现在从头组装的结果中。我迫不及待地BLAST查找它，发现相似序列都属于“巨型噬菌体”——这便是我博士阶段的Eureka时刻！不同于三年前发现I55时的无心插柳和后知后觉，此次我们几乎瞬间就意识到了它的意义——“众里寻他千百度”。

至此，转移介质已经被明确锁定到这个巨型噬菌体，我们将其命名为JPTI55，即“能协助I55转移的巨型噬菌体”（Jumbo Phage Transducing I55）。但严格来讲，上述实验只是证实了JPTI55和转移具有强相关性，想要真正证明I55是借助JPTI55转移的，还是要遵循还原论的思想，即从滤液中分离出JPTI55噬菌体。现在转移介质的身份从暗处转为明处，分离的目标就明确多了。由于巨型噬菌体在正常浓度的培养基中无法形成噬菌斑，我们查阅文献，制定了专门富集巨型噬菌体的方案，很快就得到了纯化的JPTI55，并验证了它确实能介导I55跨细菌转移。后续我们还测序了JPTI55侵染携带I55的细菌后的衣壳，确认I55是巨型噬菌体的“卫星元件”（即通过劫持噬菌体来完成跨细菌传播的可移动遗传原件），但这都属于具体细节方面的补充了。最重要的毫无疑问还是确认转移介质的身份，自此研究路线就走上了快车道，半年内就修稿重投PNAS并被顺利接收。

结语

现在，我已经到了攻读博士的收尾阶段，借着撰写毕业论文的契机，整体回顾这项工作，深感自己的幸运——而且有两次，即I55的发现和JPTI55的发现，分别确定了这几年的研究对象、解释了核心现象的机制。除了这两个幸运的瞬间，剩下的绝大多数时间都在养细菌、做克隆、铺平板，但也乐在其中——科学的乐趣固然在于万般求索后的顿悟，但也在于用重复的、平凡的、扎实的实验去测试每一个看似微不足道的假设，无论结果是否符合预期，它们都在不同程度上揭示了大自然的秘密。

实际上，我之所以享受这一研究过程，还有一个更深层次的原因。即便在许多人看来，这并非一个意义重大的课题，也谈不上是“高明”的科学问题，但以经验主义的实验方法来理解自然，本身就对我有强烈的吸引力。对我而言，这是不同于严格演绎的通往现实的另一条路径，因为我本科是数学背景，这种科学发现的偶然以及假设的验证，让我真正触摸了自然世界。得到这样的机会同样来之不易，背后的支撑源自导师给我的极大的自由、慷慨的资助和必要的鼓励，以及整个马克斯·普朗克学会对“高风险”项目的支持——这些托底，才是享受过程、顺其自然的底气。

我们爱科学、做科学，固然要学习科学知识、采纳科学方法，但归根结底是要欣赏并接受科学所描述的自然——这种发自内心的实事求是，才是我在博士训练中获得的最本质的收获——甚至比发现巨型噬菌体卫星这个成果本身更珍贵。

参考文献

[1] Zhao, Y.; Ma, Y.; Vasileiou, C.; Farr, A. D.; Rogers, D. W.; Rainey, P. B. Jumbo phage-mediated transduction of genomic islands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2025. 122 (44) e2512465122. doi:https://doi.org/10.1073/pnas.2512465122.

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