“基因敲入”是什么？这篇超全科普指南，让你彻底搞懂！

提到基因敲入（Knock in，KI），你可能会好奇它和基因敲除（Knock out，KO）有什么区别？从字面上看，敲除是去掉一个基因，而敲入则是加入一个基因。简单来说，基因敲入就像给细胞的“基因说明书”里精准添加一段新内容—— 比如给某个基因加个 “荧光标签”，让我们能看到它在哪里工作；或者替换掉有问题的基因片段，让细胞恢复正常功能。今天小源就用通俗易懂的语言，带大家搞懂到底什么是基因敲入以及构建基因敲入细胞系时要注意的关键点。

一、先搞懂：基因敲入到底是怎么回事？

要理解基因敲入，得先认识一个 “基因剪刀”——CRISPR-Cas9 系统，它是目前做基因敲入最常用的工具。该系统通过向导 RNA（Single Guide RNA, sgRNA）的序列特异性识别，引导 Cas9 核酸内切酶在靶基因位点产生DNA双链断裂（DSB），随后借助细胞内两种主要 DNA 修复途径实现外源基因整合。这两种修复途径分别是：

l 非同源末端连接（NHEJ）：修复速度快但准确性较低，常产生小片段的插入或缺失，适用于基因敲除实验。

l 同源重组修复（HDR）：在提供具有同源臂的供体模板时，可实现目标序列的精准插入，是构建基因敲入模型的关键机制。

通过HDR修复DSB时，细胞修复系统会将额外提供的一个与靶DNA两侧同源的外源片段作为模板，在DSB处合成与同源序列互补的基因序列，由于外源片段中携带待敲入的突变或目的基因，因此就可以在基因组中精确地引入点突变，或者插入目的基因，称之为基因敲入。

通俗易懂的说就是：我们可以把细胞的基因组比作一套厚厚的 “生命百科全书”，每一页都记录着特定的基因信息（DNA 序列）。基因敲入的本质，就是在这套
“百科全书” 的指定页码（目标基因位点）上，先剪一个整齐的小口，再把我们需要的 “新内容”（外源基因片段）精准放进去，最后让细胞自己启动
“修复机制”，把缺口补好。这样一来，“新内容” 就成了 “百科全书” 的一部分，会跟着细胞分裂一起复制，长期稳定发挥作用。

基因敲入的步骤简而言之，分为 3 步：

1. 找位置：让 “剪刀” 瞄准目标

我们先设计一个 “向导”—— 也就是sgRNA（小向导 RNA），它的序列能精准匹配 “百科全书” 里我们要修改的页码（目标基因序列）。sgRNA 会带着 “剪刀” Cas9 蛋白，找到这个精准位置。

2. 剪缺口：在目标处 “剪开” DNA

Cas9 蛋白像剪刀一样，在 sgRNA 瞄准的位置，把 DNA 双链剪一个 “缺口”。

3. 塞新内容：让细胞 “缝补” 时加入外源基因

我们提前准备好要 “敲入” 的外源基因片段（比如荧光蛋白基因），当细胞发现 DNA 有缺口时，会启动 “修复机制”。这时外源基因片段就会趁机 “混进去”，被细胞一起修复到 DNA 链上 —— 至此，基因敲入就完成了。

二、基因敲入构建：4 个关键注意事项

虽然原理听起来简单，但实际操作中却很容易出问题，比如敲入效率低、出现错误插入等。所以在做基因敲入时，还需注意以下 4 个方面：

1. 精准设计 sgRNA：“向导” 不能跑偏

sgRNA 是决定 “剪刀” 能不能找对位置的关键。如果 sgRNA 设计得不好，可能会 “认错人”—— 要么没找到目标位置，要么剪到了其他无关基因（即 “脱靶效应”）。

注意点：设计时要避开基因组里重复的序列，同时确保 sgRNA 与目标基因的匹配度尽可能高（最好 100% 匹配）。可以用专门的 sgRNA 设计工具（如 CRISPR Design、Benchling）辅助，同时预测脱靶风险，优先选择脱靶率低的 sgRNA。

2. 外源基因片段：“格式” 要符合细胞修复习惯

细胞修复 DNA 缺口时，对 “外源基因片段” 的 “格式” 有要求。如果外源基因片段两端的序列，和目标 DNA 缺口周围的序列不匹配，细胞就很难把它 “缝进去”。

注意点：要在外源基因片段的两端，加上和目标缺口周围一致的 “同源臂”（通常每端 200-1000 个碱基）。同源臂就像 “接口”，能让外源基因和目标 DNA 完美对接，提高敲入成功率。

3. 选择合适的 “载体”：让工具高效进入细胞

sgRNA、Cas9 蛋白、外源基因片段，这些 “工具” 不能直接扔进细胞 —— 细胞有 “细胞膜” 保护，会把它们挡在外面。这时候就需要 “载体” 帮忙，像 “快递盒” 一样把工具送进细胞。

注意点：常用的载体有 “质粒载体”“病毒载体” 等。如果是难转染的细胞（比如原代细胞），优先选病毒载体（如腺病毒、慢病毒），转染效率更高；如果是容易转染的细胞（如 HEK293 细胞），用质粒载体更方便、成本更低。

4. 细胞状态：“受体” 要健康有活力

细胞就像 “受体”，如果本身状态不好（比如老化、污染、密度过高），即使 “工具” 送进去了，也没有足够的能量完成 DNA 修复和基因敲入。

注意点：实验前要确保细胞处于 “对数生长期”（细胞活力最强、增殖最快的阶段），同时保证细胞没有污染（细菌、真菌污染会直接让实验失败），培养条件（温度、CO2 浓度、培养基）稳定。

三、FAQ：最常见的 2 个问题

FAQ1：基因敲入效率太低，怎么办？

这是最常见的问题，通常可以从 3 个方面排查优化：

• 优化 sgRNA：如果 sgRNA 效率低，换 1-2 个预测效率更高的 sgRNA 试试；也可以把 2 个 sgRNA 一起用（双 sgRNA），在目标位置剪一个更大的缺口，提高外源基因插入机会。

• 调整载体浓度和转染条件：载体浓度太低，进入细胞的 “工具” 不够；浓度太高会损伤细胞。可以做梯度实验，找到最合适的载体浓度；同时优化转染试剂的比例、转染时间，提高转染效率。

• 选择更高效的修复方式：细胞的 DNA 修复有两种主要方式，“同源定向修复（HDR）” 和 “非同源末端连接（NHEJ）”。基因敲入主要依赖 HDR，但 HDR 在多数细胞中效率较低。可以用 “小分子激活剂”（如 RS-1）激活 HDR，或使用NHEJ抑制剂（如SCR7）抑制NHEJ，从而提高敲入效率。

FAQ2：如何设计 sgRNA 方案？新手容易踩哪些坑？

设计 sgRNA 方案，记住 “3 步走 + 避 2 坑”：

• 3 步设计法：

① 确定目标基因的 “敲入位点”：想在哪个位置插入外源基因（比如基因的起始密码子附近，方便外源基因表达），找到对应的 DNA 序列。

② 用工具设计 sgRNA：在设计工具中输入目标序列，工具会自动生成多个 sgRNA 候选，同时给出效率评分和脱靶风险。

③ 筛选最优 sgRNA：优先选 “效率评分≥70 分、脱靶风险低” 的 sgRNA，最好选 2-3 个备用（避免某一个 sgRNA 实际效率差）。

• 新手易踩的 2 个坑：

① 没避开 “基因功能区”：如果 sgRNA 的剪切位置在基因的关键功能区，可能会破坏原有基因功能，要提前查目标基因的结构，避开关键区域。

② 忽略 “PAM 序列”：Cas9 蛋白需要识别 “PAM 序列”（通常是 NGG，N 代表任意碱基）才能剪切 DNA，设计 sgRNA 时一定要确保目标序列附近有 PAM 序列，否则 Cas9 无法工作。

总结

基因敲入本质上是用 “基因剪刀 + 修复机制”，给细胞基因组 “精准加内容” 的技术。要想玩转基因敲入技术，需要先搞懂 CRISPR-Cas9 的核心逻辑，再重点关注 sgRNA 设计、外源基因同源臂、载体选择和细胞状态这 4 个关键点，同时遇到问题时要针对性排查（比如效率低就优化 sgRNA 或修复方式），做到以上几点你也可以轻松搞定基因敲入细胞系。

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