河南省郑州地区青铜时代遗址出土牛骨的DNA研究

　　在中国， 黄牛泛指牦牛（Bos granuiens） 和水牛（Bubalus bubalis）以外的所有家牛，主要分为普通牛（Bos taurus）和瘤牛（Bos indicus）两个种。

就世界范围而言，普通牛分布于全世界，瘤牛主要分布于印度次大陆，均由已灭绝野生原牛（Bos primigenius）驯化而来。综合考古学与DNA 研究表明，家养黄牛有两个独立的驯化中心， 普通牛于公元前8000 年左右在近东地区由野生原牛驯化而来，瘤牛于公元前6000 年左右在南亚被独立驯化。

　　动物考古学证据表明， 家养普通牛于公元前3600 年～公元前2000 年从西亚传入中国。关于瘤牛最早的考古证据来自于公元前475～公元前221 年的青铜器，该青铜器纹饰上有肩峰高耸的家牛形象，但是瘤牛何时传入中国目前尚不清楚。

饲养黄牛不仅为人类提供稳定的动物蛋白， 牛耕的发明使黄牛成为传统农耕经济的主要畜力， 使人们可以从繁重的体力劳动中解放出来。此外，饲养黄牛为宗教活动提供了新的物种来源， 并且大部分早期家牛遗存都来源于宗教祭祀有关的遗迹。到了商代晚期（ca.1600-1046 BCE）， 黄牛已经代替家猪成为中国考古遗址中最主要的祭牲。

　　蔡大伟等采集了中国河南、山西、陕西、吉林、内蒙古、新疆、青海、宁夏等多个考古遗址出土的牛骨样本进行DNA 分析，研究认为：中国家养黄牛最早由近东地区引入中国； 青铜时代中国北方黄牛均为普通牛，未见瘤牛；近东起源的普通牛可能经过两条路线进入中国； 中国古代家牛对现代东亚家养普通牛具有重要的遗传贡献。

博凯玲等对山西陶寺、周家庄遗址出土牛卜骨的DNA 研究显示，新石器时代晚期至青铜时代早期中国北方地区依然存在野生原牛， 野生原牛、野生水牛和家养黄牛种群共存。并且首次发现使用原牛肩胛骨制作卜骨的现象。

　　动物考古学研究表明，全新世时期中国境内很多地方有水牛（Bubalus sp.）生存，这些土生土长的中国水牛被称为圣水牛（Bubalus mephistopheles），曾被认为是现代家养水牛的祖先。现研究表明它们可能没有被驯化， 应该是野生水牛。

中国最早的家养水牛（Bubalus bubalis）可追溯至1 世纪之后。现代动物线粒体DNA 研究显示，沼泽水牛（Swamp type）可能在中国西南部或东南亚被驯化。对陕西省临潼康家遗址等几个遗址出土水牛的古DNA 研究显示，在公元前2000 年左右的中国北方考古遗址中出土的圣水牛对中国现代家养水牛没有基因贡献。

　　河南省郑州地区地处华北平原南部、黄河下游，居中原地区核心位置。本文对河南省郑州地区青铜时代的花地嘴遗址和望京楼遗址出土的牛骨进行了采集、DNA 提取，并选择线粒体DNA 控制区片段进行PCR 扩增，研究郑州地区古代牛的群体遗传学特征，并通过与国内外的古代和现代牛的比较，分析郑州地区特别是中原地区在中国古代牛的出现与发展过程中所起的作用。

　　一、材料与方法

　　1、样本采集

　　花地嘴环壕聚落遗址位于河南省巩义市站街镇北瑶湾村南面的黄土原上，东、南远望猴山等嵩山余脉，西临伊洛河，北为断崖，远眺黄河，海拔高度为90～110 米。

是一处由四条环壕围成的夏代早期聚落遗址，内部分布有夯土、房址、窑址、祭祀坑、窖穴及墓葬等重要遗迹，而且出土了大量陶器、玉器、骨器、石器、蚌器等遗物，所有这些将有助于推动对夏代早期文化的认识和深入研究。

　　望京楼遗址位于河南省新郑市以北约4000 米处，处于豫西山地丘陵区东缘冲积扇中部，西北高、东南低。西邻黄水河，东临黄沟水（黄水河支流），两条河流于遗址东南汇合。望京楼二里头文化城址与二里冈文化城址同位于此地点，是夏、商时期的重要邑聚。

　　在动物考古学家进行种属鉴定等形态学研究的基础上， 本文对花地嘴遗址和望京楼遗址出土的共计29 例牛骨样本（花地嘴遗址12 例、望京楼遗址17例）进行了采集，样本的具体信息见表一。

　　2、样本处理与DNA 提取

　　首先取牛骨上约1cm×1cm 见方的小块， 用钻头打磨骨骼表面和截面以去除骨骼表面尘垢， 次氯酸钠溶液（有效氯6％）浸泡和紫外照射（紫外灯置于样本以上8cm 的高度，波长254nm），用以去除骨骼表面的外源DNA 污染， 之后使用冷冻研磨机打磨成粉。在此基础上采用Yang 等提出的硅柱离心法进行DNA 提取。

　　3、DNA 扩增与测序

　　由于古DNA 的含量低、高度降解、广泛损伤，几乎不可能一次性扩增较长的片段。为了得到较长的连续DNA 序列，本文选择了Troy 等、蔡大伟等设计的三对套叠引物（L16022/H16178，L16137/H16315和L16159/H16334） 来扩增黄牛线粒体DNA 控制区的片段（16022～16334，包括引物长度），并选择Yang等设计的引物（F213/R381） 来扩增水牛线粒体DNA 控制区的片段（16004～16172，包括引物长度）。

　　在古DNA 研究中，PCR 扩增常用的BSA （牛血清白蛋白，Albumin from bovine serum）是从牛中提取的， 本文的研究对象是古代牛的DNA， 因此实验时并未使用BSA。PCR 反应体系为30μL，包括4-5μL的DNA 提取液、1 -3U AmpliTaq GoldTM （AppliedBiosystems）、50 mM KCl、2.5mM MgCl2、0.2mMdNTPs Mix 和0.3μM 引物。PCR 扩增程序如下：95℃ 12min，随后是94℃变性30s、52-55℃退火30s、72℃延伸40s 共60 个循环，最后72℃延伸10min。

扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR 阳性产物送到测序公司（Invitrogen）直接测序，正反引物双向测序。在全部实验过程中，严格按照防污染措施操作，具体实验操作详见。

　　4、数据分析

　　PCR 产物所得到的序列使用Chromas Pro 软件进行读取，通过Clustal X2 软件进行序列比对，并使用BioEdit 进行编辑。使用MEGA 6 软件构建系统发育树，对比序列包括：普通牛单倍型类群T1（Gen-Bank：JN817351和GenBank：MF475809）、普通牛单倍型类群T2 （GenBank：KT184456 和GenBank：MF475825 ）、普通牛单倍型类群T3 （GenBank：V00654 ）、普通牛单倍型类群T4 （GenBank：DQ124372）和瘤牛单倍型类群I（GenBank：EU177868和EU177870） ，水牛（GenBank：NC_006295 ）作为外类群，详见图一。

使用Network 5.0 软件构建中介网络图，选择中国考古遗址出土家养普通牛作为对比序列，包括：吉林后套木嘎、山西周家庄、山西陶寺、河南二里头、陕西石峁、陕西泉护村、辽宁大山前、青海长宁、新疆小河等，详见图二。

　　二、结果

　　在29 例牛骨样本中，本文成功地获得了14 个样本线粒体DNA 控制区的285bp 序列（16029～16313，去除两端引物），另有2 个样本（BOC82、BOC85）获得了部分线粒体DNA 控制区序列。

在GenBank 数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）对这些DNA 序列进行了BLAST 共享序列搜索，结果发现15 个样本属于家养普通牛（花地嘴遗址5 个、望京楼遗址10个），1 个样本（花地嘴遗址BOC82）属于水牛。

　　1、普通牛线粒体DNA 控制区序列变异情况及单倍型类群归属

　　以V00654作为参考序列， 将属于家养黄牛的15 个线粒体DNA 控制区序列与之进行比对，BOC85仅获得了部分线粒体DNA 序列（16029～16158，去除两端引物），实验结果见表二。共检测出10 个多态性位点，8 个为转换，1 个为颠换（16057G→C）， 另16302 位点既有转换（G→A）也有颠换（G→T），转换主要在嘧啶之间，占75.0%（6/8），遗传多态性不高。除BOC85 外， 其他14 个序列中共检测出8 个单倍型。

BOC64、BOC65、BOC73 和BOC79， BOC57、BOC71 和BOC83，BOC67 和BOC77 分别共享有相同的单倍型， 并且这三个单倍型在花地嘴遗址和望京楼遗址均有发现。

　　根据已发表研究成果关于普通牛单倍型类群的划分，基于线粒体DNA 控制区序列变异模式，本文发现的8 个单倍型可以归属于3 个不同的单倍型类群T2、T3 和T4， 以T3 为主占60.0%，T4 次之约占26.7%，T2 最少约占13.3%， 未见其他单倍型类群。以每个遗址为单位分别统计，比例相似。在花地嘴遗址中， 以T3 为主占60.0% ，T2 和T4 各占20.0%；在望京楼遗址中，以T3 为主占60.0%，T4 次之占30.0%，T2 最少占10.0%。

　　2、水牛线粒体DNA 控制区序列变异情况及单倍型类群归属

　　以NC_006295 和AY195595 作为参考序列，将属于水牛的BOC82 的线粒体DNA 控制区序列与之进行比对，并与康家水牛进行比较，实验结果见表三。根据已发表研究成果关于水牛单倍型类群的划分，基于线粒体DNA 控制区序列变异模式，本文发现的这1 例水牛的单倍型可以归属于单倍型类群KJ2，与康家遗址的5个个体、天马纱厂遗址的1个个体共享相同的线粒体DNA 控制区序列。

　　三、讨论

　　1、普通牛线粒体DNA 研究

　　二十世纪九十年代学术界开始在世界范围对现代家养黄牛进行遗传学研究， 以探讨其起源与驯化历史。综合这些关于线粒体DNA 控制区的分析，黄牛分为普通牛和瘤牛两个基因型； 普通牛有T、T1、T2、T3、T4、T5 和P、Q、R 等单倍型类群，其中T、T2和T3 主要分布于近东和欧洲，T1 主要发现于非洲，T4 仅见于东亚， 单倍型类群T5 发现于意大利黄牛种群中。由于T4 只存在于东亚，所以有学者认为东亚也是一个独立的普通牛驯化中心。

然而，最近研究显示T4 是单倍型类群T3 的一个分支。此外还有学者认为欧洲牛起源较为复杂，并非简单地近东引入，欧洲原牛对欧洲普通牛有基因贡献，例如普通牛中稀有的线粒体DNA 单倍型类群P、Q、R 等反映了家养普通牛和欧洲原牛之间存在杂交。

​目前在东亚地区还未发现东亚本地原牛种群与外来家养黄牛种群之间存在杂交。瘤牛包括I1 和I2 两个单倍型类群。

　　中国现代黄牛的线粒体DNA 分析结果表明中国黄牛包含普通牛和瘤牛两种， 普通牛主要分布在北方，瘤牛主要分布在南方。在普通牛中发现单倍型类群T1、T2、T3 和T4，在瘤牛中发现单倍型类群I1和I2。

　　中国所有已知的古代家养黄牛均属于普通牛的线粒体DNA 单倍型类群， 公元前2000 年前后单倍型类群T2、T3 和T4 在中国已全部存在。没有考古学或遗传学方面的证据表明中国家养黄牛是由本地野牛驯化而来。

　　目前人们对于东亚地区原牛的遗传学信息还知之甚少。对中国东北地区的一个全新世早期牛下颌骨进行了线粒体DNA 全基因组测序，发现了一个新的牛线粒体DNA 单倍型类群C。此外，在周家庄輬輰訛和后套木嘎也发现了同属于C 的牛的样本，但是其年代已经进入新石器时代晚期。而该单倍型类群C不同于其他已知的现代普通牛单倍型类群， 对现代家养普通牛没有遗传贡献。

　　本文对花地嘴和望京楼两个遗址出土牛骨的线粒体DNA 研究显示，家养普通牛可以归属于单倍型类群T2、T3 和T4，以T3 为主，T2 和T4 较少（见图一）， 这一遗传结构特征与中国现代家养普通牛相似，但未见其他单倍型类群。将这两个遗址与已发表的其他中国考古遗址出土黄牛线粒体DNA 的单倍型类群分布频率进行比较（见表四），本文发现花地嘴和望京楼家养普通牛的线粒体DNA 单倍型类群分布频率与其他遗址相似， 但是同时存在T2、T3 和T4 的遗址中，除本文研究的两个遗址外，仅有河南二里头遗址和辽宁大山前遗址两个， 说明河南地区古代家养黄牛的多样性更高。中介网络分析（见图二）显示，花地嘴、望京楼和二里头这三个遗址中常见的单倍型都在其他遗址中有发现。

　　广义的中原， 指黄河中下游地区； 狭义的中原，指今河南一带。“今韩、魏，中国之处而天下之枢也”，这里的“中国”即为中原，自古为咽喉要地，是华夏文明和中华文明的发源地， 随着华夏民族的大融合以及中原文明的扩展， 中原文化与其他文化交流频繁。花地嘴遗址是夏代早期聚落遗址，望京楼遗址是夏、商时期的重要邑聚，二里头更是夏时期都城性质的遗址。这三个遗址均位于今河南省，其重要的考古学文化性质及地理位置， 便于各种家养黄牛通过不同的路线汇聚于此， 由此形成了本文看到的这三个遗址都存在T2、T3 和T4 三个家养黄牛的线粒体DNA 单倍型类群，并且作为一种稳定的遗传结构在该地区长期保留下来了。

　　2、水牛线粒体DNA 研究

　　Yang 等对陕西省7 个考古遗址出土的水牛样本进行了线粒体DNA 分析，认为这些水牛都属于已灭绝的圣水牛（Bubalus mephistopheles），并且可以划分为两个单倍型类群KJ1 和KJ2。这些本土野生的圣水牛对现代家养水牛没有遗传贡献。此外，在山西龙山时期周家庄遗址中发现了属于KJ1 的牛骨样本。本文在花地嘴遗址中发现的水牛样本（BOC82）属于圣水牛的单倍型类群KJ2， 与康家遗址的5 个个体、天马纱厂遗址的1 个个体共享有相同的线粒体DNA序列。

　　四、结论

　　通过对河南省郑州地区花地嘴遗址、望京楼遗址出土牛骨进行线粒体DNA 控制区序列的分析，并结合该地重要的地理位置，本文得出以下认识：

　　（1） 花地嘴遗址出土的牛骨包括有家养普通牛和野生的圣水牛两个不同的种， 望京楼遗址出土的牛骨均属于家养普通牛。

　　（2）花地嘴遗址、望京楼遗址的家养普通牛可以归属于线粒体DNA 单倍型类群T2、T3 和T4，以T3为主，T2 和T4 较少，这一遗传结构特征与中国现代家养普通牛相似，但未见其他单倍型类群。通过与已发表的其他中国考古遗址出土黄牛线粒体DNA 的单倍型类群分布频率的比较发现， 同时存在T2、T3和T4 的遗址中，除本文研究的两个遗址外，仅有河南二里头遗址和辽宁大山前遗址两个， 说明河南地区古代家养黄牛的多样性更高。综合花地嘴遗址、望京楼遗址和二里头遗址重要的考古学文化性质及地理位置， 本文研究认为各种家养黄牛便于通过不同的路线汇聚于此， 由此形成了本文看到的这三个遗址都存在T2、T3 和T4 三个家养黄牛的线粒体DNA单倍型类群， 并且作为一种稳定的遗传结构在该地区长期保留下来了。

　　（3）花地嘴遗址中发现的水牛样本（BOC82）属于圣水牛的单倍型类群KJ2，与康家遗址、天马纱厂遗址等多个个体共享有相同的线粒体DNA 序列。它们之间是否具有某种联系， 还需要有进一步的研究和探讨。

　　致谢感谢郑州市文物考古研究院为本研究提供了宝贵的样本。

（作者：赵欣 中国社会科学院考古研究所科技考古中心 西蒙菲莎大学（Simon Fraser University）考古学系古DNA实验室；顾万发 吴倩 东晓玲 郑州市文物考古研究院；韩雨 刘铭 中国社会科学院考古研究所科技考古中心；尤悦 首都师范大学历史学院；刘一婷  袁靖 中国社会科学院考古研究所科技考古中心；杨东亚（通讯作者） 中国社会科学院考古研究所科技考古中心 西蒙菲莎大学（Simon Fraser University）考古学系古DNA实验室；原文刊于《南方文物》2018年第4期 　此处省略注释，完整版请点击左下方“阅读原文”）