从CRISPR筛选到靶向干预：GSK3β 在 B-ALL 中的关键作用

经典Wnt/β-连环蛋白信号通路中，β-连环蛋白降解失衡被认为是多种肿瘤发生的重要推手，但其在B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中究竟是“促癌”还是“抑癌”，长期存在争议。Kadriye
Nehir Cosgun团队在Nature Cancer发表的最新研究显示：通过
CRISPR筛选等核心技术证实，研究者发现B-ALL细胞的存活反而依赖于β-连环蛋白的持续高效降解。当使用GSK3β抑制剂
阻断这一过程时，β-连环蛋白会重新分配并与Ikaros/NuRD抑制复合物结合，进而下调MYC转录程序，最终触发白血病细胞死亡。该研究从机制层面澄清了经典通路在B-ALL中的“反常角色”，并为耐药性B细胞恶性肿瘤提供了全新的靶向干预思路。

急性淋巴细胞白血病是血液系统中发病率较高的恶性肿瘤之一，尽管现有治疗方案不断优化，仍有一部分患者疗效有限，临床上迫切需要挖掘新的干预靶点与治疗思路。作为经典肿瘤相关信号轴，Wnt/β-连环蛋白通路中β-连环蛋白稳态失衡常与肿瘤发生发展密切相关，但这一通路在B-ALL中究竟发挥何种作用，长期缺乏清晰结论。已有研究表明，GSK3β是介导β-连环蛋白降解的核心调控因子，其抑制剂在多项临床研究中显示出较好的安全性和可耐受性，这也为进一步评估其在B-ALL中的潜在治疗价值奠定了现实基础。

阐明B-ALL中β-连环蛋白降解的独特作用及分子机制，验证GSK3β抑制剂靶向β-连环蛋白降解的治疗效果，为难治性B细胞恶性肿瘤提供新的治疗方向。

研究综合采用多层级模型，包括人源与小鼠B-ALL细胞系、患者来源的异种移植模型（PDX），以及多种基因工程小鼠模型（如Apc、Gsk3b条件突变及稳定型 β-连环蛋白相关模型），以系统评估关键通路在体内外的生物学效应。

基因操作策略借助CRISPR-Cas9技术，在细胞和小鼠水平构建多种基因敲除或功能突变模型，例如IKZF1/IKZF3双敲除、β-连环蛋白关键磷酸化位点缺失等，用于解析基因功能及调控关系。

CRISPR 文库筛选研究选用小鼠全基因组敲除EKO
sgRNA文库，覆盖近 2.3 万个编码基因、约28万条sgRNA（每个基因约 12 条
sgRNA，并含阴性对照）。通过慢病毒方式将文库导入NALM6细胞，并严格控制转导条件，使单个细胞平均仅携带一条
sgRNA，以保证筛选结果的可靠性。

分子机制解析在机制层面，研究结合免疫共沉淀、质谱分析及Western blot明确蛋白互作网络；利用RNA-seq与GSEA分析转录组变化及通路重塑；通过ChIP-seq技术评估关键因子在染色质上的结合特征。

功能与表型验证通过流式细胞术、集落形成实验及细胞活力检测 系统评估细胞增殖和死亡情况；同时在动物模型中开展体内干预实验，动态监测肿瘤负荷变化及生存结局。

药物反应评估结合公共功能基因组学资源（如 DepMap）与临床前实验数据，系统分析GSK3β抑制剂的细胞选择性及抗肿瘤效果，为其潜在临床应用提供依据。

表型特征分析围绕 B-ALL 中 β-连环蛋白的表达水平与稳态调控方式展开研究，重点评估其对蛋白降解过程的依赖程度，并与实体瘤及其他 B 细胞来源恶性肿瘤进行系统比较，揭示其特异性差异。

分子机制阐释从功能必需性角度出发，确认 GSK3β 介导的 β-连环蛋白降解在维持 B-ALL 细胞存活中的关键作用，并深入解析 β-连环蛋白与 Ikaros/NuRD 抑制复合物协同调控 MYC 转录活性的分子基础。

治疗效应评估在体外培养的细胞体系、类器官模型以及体内动物模型中，系统检测 GSK3β 抑制剂的单药抗肿瘤活性，重点分析其治疗效果及对不同细胞类型的选择性。

临床相关性验证结合患者来源的临床样本与 PDX 模型，进一步评估 GSK3β 抑制策略在难治性 B-ALL 中的应用潜力，为临床转化提供实验支持。

1.B-ALL 中 β- 连环蛋白呈低表达且依赖高效降解

与实体瘤相比，小鼠和人类
B-ALL 细胞中 β- 连环蛋白 mRNA 水平正常，但蛋白水平极低，仅为实体瘤的 1/32。B-ALL 细胞中 β- 连环蛋白 N
端持续被 GSK3β 磷酸化，处于持续蛋白酶体降解状态，未检测到稳定的非磷酸化活性形式。临床样本分析显示，B 细胞恶性肿瘤中 β-
连环蛋白降解通路（CTNNB1、APC、AXIN1 等）的致病变异率显著低于实体瘤。

图1.B淋巴细胞表达 β -连环蛋白mRNA但缺乏 β -连环蛋白表达

2.β- 连环蛋白降解是 B-ALL 生存与白血病起始的关键

基因敲除实验证实，APC、GSK3β
或 CK1α 的单等位基因缺失会导致 β- 连环蛋白积累，诱导 B-ALL 细胞急性死亡及集落形成能力丧失。体内实验中，阻断 β-
连环蛋白降解可显著降低白血病起始细胞能力（LIC 从 1/1042 降至 1/40063），延长移植小鼠生存期。B 细胞特异性 β-
连环蛋白磷酸化位点缺失会导致 B 淋巴细胞生成停滞于前 B 细胞阶段，证实 B 细胞发育依赖 β- 连环蛋白降解。经 CEBPα 介导将
B-ALL 重编程为髓系细胞后，其对 β- 连环蛋白积累的敏感性消失，表明降解依赖性是 B 细胞特性决定的。

图2.B细胞恶性肿瘤的独特依赖性在于高效降解 β -连环蛋白。

3.β- 连环蛋白积累通过抑制 MYC 诱导 B-ALL 细胞死亡

RNA-seq
及 GSEA 分析显示，β- 连环蛋白积累会显著抑制 MYC 靶基因集，同时上调 Wnt 通路负调控因子（Axin2、Nkd1
等）。双报告基因实验直观显示，GSK3β 抑制剂处理后，β- 连环蛋白积累与 MYC 表达呈负相关，10 小时后 MYC 信号显著下调。过表达
MYC 可挽救 β- 连环蛋白积累介导的细胞死亡，恢复集落形成能力；而敲除 β- 连环蛋白则可逆转 GSK3β 抑制剂对 MYC 的抑制作用。

图3.B细胞中 β -连环蛋白降解受损导致MYC转录抑制。

4.β- 连环蛋白与 Ikaros/NuRD 复合物形成抑制性复合物

免疫共沉淀及质谱分析证实，B-ALL
中 β- 连环蛋白不与经典 TCF 因子结合，而是与 B 细胞特异性转录因子 IKZF1/3（Ikaros/Aiolos）及 NuRD
复合物（Chd4、Mta1/2 等）相互作用。IKZF1/3 双敲除可破坏 β- 连环蛋白与 NuRD 复合物的结合，逆转 MYC
抑制及细胞死亡表型；单独敲除 IKZF1 或 IKZF3 无此效果。跨谱系对比显示，β- 连环蛋白与 Ikaros/NuRD 的相互作用为 B
淋巴系特异性，实体瘤中 β- 连环蛋白主要与 TCF 家族结合。

图4.β -连环蛋白与B淋巴样转录因子Ikzf1和Ikzf3形成抑制性复合物

5.Ikaros-β- 连环蛋白复合物在 MYC BENC 增强子介导转录抑制

ChIP-seq
显示，约 72.2% 的 β- 连环蛋白结合峰与 Ikaros 重叠，二者共同富集于 MYC 的造血特异性 BENC 增强子区域。β-
连环蛋白积累会招募 NuRD 复合物，抑制 BENC 区域 H3K27ac 修饰（活性增强子标记），进而抑制 MYC 转录。突变 BENC
区域的 Ikaros 核心结合基序（GGGAA）可阻断 β- 连环蛋白介导的 MYC 抑制，维持细胞存活及竞争性适应度。

图5.在MYC BENC增强子区域中识别出Ikaros基序，这对于β-连环蛋白介导的MYC抑制是必需的

6.GSK3β 抑制剂对 B-ALL 具有选择性治疗效果

药物敏感性分析显示，GSK3β
抑制剂（LY2090314、CHIR99021 等）对 B 细胞恶性肿瘤的毒性显著高于实体瘤，B-ALL 的 EC50 值较实体瘤低 176
倍。 CRISPR 化学基因组筛选证实，CTNNB1（β- 连环蛋白）敲除可最显著挽救 GSK3β 抑制剂介导的细胞死亡，验证 β-
连环蛋白降解是其核心靶点。 敲除 β- 连环蛋白的 B-ALL 细胞（BV173、PDX2）对 GSK3β
抑制剂完全耐药，进一步证实药物作用依赖 β- 连环蛋白积累。基因表达相关性分析显示，IKZF1/3 高表达与 GSK3β
抑制剂敏感性正相关，TCF7L1/2 高表达则与耐药相关。

图6.小分子抑制β-连环蛋白降解诱导B细胞选择性死亡

7.GSK3β 抑制剂在难治性 B 细胞恶性肿瘤中的临床转化潜力

GSK3β
抑制剂对化疗敏感及难治性 B-ALL PDX 模型均有效，且不受 IKZF1 缺失状态影响。携带 MYC 易位（8q24+）的 B
细胞淋巴瘤对 GSK3β 抑制剂敏感性显著降低，为临床患者分层提供依据。体内实验中，LY2090314 单药治疗可显著降低难治性 B-ALL 及
MCL PDX 的肿瘤负荷，延长小鼠生存期（P 值范围 6.5×10⁻⁴~1.2×10⁻⁵）。治疗后小鼠无明显器官毒性，且 B-ALL
细胞表型无显著改变，证实其安全性。

图7.GSK3β 抑制剂用于难治性B淋巴细胞恶性肿瘤的再利用依据

本研究系统阐明了
B-ALL 对 β-连环蛋白持续降解的依赖性生存模式。在这一过程中，GSK3β 主导的降解机制阻止 β-连环蛋白与 Ikaros/NuRD
抑制复合物发生结合，从而维持 MYC 转录程序的活跃状态并支持白血病细胞存活。当 GSK3β 抑制剂
介入后，β-连环蛋白的降解被打断，其在细胞内逐步累积并转而参与转录抑制复合体的形成，最终导致 MYC 下调并触发 B 细胞来源肿瘤的选择性死亡。

这一发现不仅重新定义了 β-连环蛋白在 B-ALL 中的功能定位，也巧妙地将机制研究与临床现实相衔接，提示已进入临床阶段的 GSK3β 抑制剂有望成为应对难治性 B 细胞恶性肿瘤的潜在治疗方案，具有明确的转化应用前景。

RISPR-iScreen™ 是 源井生物 自主研发的 CRISPR 功能筛选技术平台，核心目标是提升筛选效率与数据稳定性。基于该平台，源井生物已建立较为完善的 CRISPR 文库体系，覆盖人类、小鼠、绿猴、猪等多种物种，支持全基因组层面的基因敲除、转录抑制及激活研究；还有针对激酶、细胞周期、膜蛋白、代谢等相关基因构建的CRISPR敲除/抑制/激活亚文库，助您轻松实现靶点筛选！在实验实施层面，平台提供多种文库形式（如文库病毒与文库Cell Pool），并支持体内与体外 CRISPR 文库筛选流程，便于不同研究场景下的应用与扩展。此外，配套的 iScreenAnlys™ 数据分析平台 集成多种主流筛选分析算法（包括 Drug-Z、MAGeCK-MLE 和 MAGeCK-RRA），可实现从测序数据到候选基因优选的标准化分析流程，降低筛选数据处理门槛，提升结果解读效率。