紧凑CRISPR文库构建技巧，轻松实现高精度筛选

在CRISPR筛选实验中，sgRNA文库的均一性直接影响结果可靠性。传统文库构建方式存在分布偏斜，部分sgRNA丰度过低甚至丢失。为了避免假阴性，通常需要在较高细胞覆盖度（≥300×）下进行筛选，但对于难以扩增的细胞类型（如iPSC衍生细胞、原代细胞）几乎不可行，限制了CRISPR筛选的应用范围。近期研究提出了一种改进的sgRNA文库克隆策略——通过优化双向模板和克隆条件，构建出更紧凑、均一的CRISPR文库（LGR文库），显著降低了文库分布偏斜，使低覆盖度筛选仍能获得可靠结果。

一、研究背景：从克隆偏差到筛选瓶颈

CRISPR筛选依赖sgRNA文库在细胞群体中的均匀分布。然而，常规文库在构建中存在克隆和扩增偏差，低丰度sgRNA在筛选过程中容易被忽略。为避免信息丢失，研究人员通常需要提高细胞覆盖度，这增加了实验成本和操作难度。虽然一些方法尝试通过压缩文库设计减少规模，但可能带来重组和统计复杂性。相比之下，优化文库克隆过程可更直接地改善文库均一性。

二、优化策略：实现更高质量的CRISPR文库

研究团队总结出一套通用的优化方案，使全基因组文库的sgRNA分布更加均匀。

1. 模板合成：双向sgRNA文库以往文库通常仅使用单向模板或未明确说明双向模板的使用。新策略采用双向模板进行克隆，减少了文库偏差和sgRNA丢失。

2. 模板克隆：优化PCR循环通过比较不同DNA聚合酶性能并调整PCR扩增次数，研究发现额外PCR循环会引入轻微偏差和非目标片段过度扩增。优化PCR循环次数和模板浓度能有效降低文库偏差。

3. 片段插入：低温洗脱在小规模文库中，降低洗脱温度可提升sgRNA均一性。扩大到全基因组文库时，结合前述优化条件并进一步降低洗脱温度，可消除因sgRNA Tm差异引起的偏差。

4. 文库克隆：单次整体克隆传统全基因组文库分为多个子文库独立克隆，每个子库偏斜不同。新策略通过一次性克隆整个文库，生成更均一的sgRNA分布，并减少丢失。

三、效果展示：LGR文库的性能提升

1. 支持低覆盖度筛选实验显示，在100×覆盖度下，LGR文库依然能够高效命中必需基因，AUC可达0.949，并且与高覆盖度筛选结果高度一致。这表明低覆盖度下也能进行全基因组规模筛选。

2. 更多候选基因命中在药物生存筛选实验中，LGR文库相较传统文库发现了更多必需基因和药物相关基因命中，特别是在介质复合物和氧化磷酸化途径相关基因中表现突出。

四、技术优势与意义

1. 减少细胞用量：文库均一性提高，使低覆盖度（如50×）即可进行全基因组筛选。

2. 筛选结果更可靠：均一分布减少假阴性或假阳性，提高数据准确性。

3. 拓展应用范围：适用于难扩增或特殊细胞类型的全基因组筛选，也可推广至不同CRISPR系统及衍生技术。