SARS-CoV-2校对酶识别错配的结构基础

冠状病毒 3'-5' 外切核糖核酸酶 (ExoN) 位于非结构蛋白 (nsp) 10-nsp14 复合物中，通过校对 RNA 合成来提高复制保真度，并且对病毒生命周期至关重要。ExoN 还识别并切除整合到新生 RNA 中的核苷酸类似物抑制剂，从而削弱基于核苷酸类似物的抗病毒药物的有效性。在这里，我们展示了野生型和突变型 SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 与带有 3' 端错配的 RNA 底物复合物的冷冻电子显微镜结构，分辨率范围为 2.5 Å 至 3.9 Å。这些结构揭示了 ExoN 底物特异性的分子决定因素，并深入了解了冠状病毒 RNA 合成过程中错配校正的分子机制。我们的研究结果为合理设计改进的抗冠状病毒疗法提供了指导。

SARS-CoV-2 是 COVID-19 大流行的病原体，已感染超过 1.6 亿人，并导致全球超过 300 万人死亡 ( https://covid19.who.int )。虽然现在有几种 SARS-CoV-2 疫苗可用 ( 1 )，但没有高效的抗病毒药物来治疗这种疾病。SARS-CoV-2 最重要的药物靶点之一是其复制/转录复合体 (RTC)，这是一种多亚基机器，可进行病毒基因组复制和转录，并在病毒生命周期中发挥重要作用 ( 2 , 3）。冠状病毒 RTC 的核心是核心 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRp)、nsp12 ( 4 ) 和两个相关的辅助蛋白 nsp7 和 nsp8 ( 5）。SARS-CoV-2 RdRp 是核苷酸类似物抗病毒药物（例如瑞德西韦）的一个有前景的靶标 ( 6 , 7 )。但是，核苷酸类似物抑制剂对冠状病毒的RdRp的效力是由病毒nsp14的存在损害核糖核酸外切酶（外显子）（8，9），一个RNA校对特有冠状和型Nidovirales顺序和关键的一些其他密切相关的病毒家族保持其异常大的 RNA 基因组的完整性 ( 9 – 11）。另外，从冠状病毒等RNA病毒外显子通过降解，否则将被宿主病原体识别受体（识别病毒双链RNA（dsRNA的）中间发挥的宿主免疫应答逃避了重要作用12 - 15）。

Nsp14是一个双功能酶，其既港口的3'-5'外显子和mRNA帽鸟嘌呤-N7甲基（N7-转移酶）活性（16，17）（图1A）。nsp14 的 N 端外显子结构域通过从新生 RNA 中去除错误掺入的核苷酸或核苷酸类似物来提高 RNA 合成的保真度，而 C 端 N7-MTase 结构域参与病毒基因组和亚基因组信使的 5' 加帽过程RNA ( 16 – 18 )。nsp14 的 ExoN 活性受到 nsp10 的刺激，nsp10 与 ExoN 结构域结合并有助于稳定 ExoN 活性位点的结构。 18）。先前对 SARS-CoV nsp10-nsp14 复合物的研究将 nsp14 ExoN 域定义为 DED/EDh 型外切核酸酶，并通过结构比较和诱变分析确定了五个活性位点残基 ( 19 )。然而，冠状病毒 nsp10-nsp14 ExoN 与底物结合的分子细节仍不清楚。此外，病毒 ExoN 如何识别和切除新合成 RNA 3' 端错误掺入的核苷酸或核苷酸类似物抑制剂，我们知之甚少。

图 1 SARS-CoV-2 nsp10-nsp14-RNA 复合物的结构和功能概述。

( A ) SARS-CoV-2 nsp10 和 nsp14 的域组织。域边界残基被编号。nsp14 ExoN 域中的五个催化残基用红点表示并标记。( B ) SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 ExoN 复合物对 T35P31 RNA 底物的切割。标明了野生型 (WT) 或 E191A 突变型 ExoN 的浓度（以 nM 为单位）。RNA 通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 解析并通过 SYBR Gold 染色。显示了三个生物学重复的代表性结果。（C ) 用于生化表征和结构测定的 T35P31 RNA 底物的序列和编号。T-链，模板链；P链，产品链。T 链和 P 链 RNA 由 UUCG 四环连接。( D) SARS-CoV-2 nsp10-nsp14-RNA复合物单体形式的冷冻电镜图和原子模型。( E ) SARS-CoV-2 nsp10-nsp14-RNA复合物四聚体形式的冷冻电镜图和原子模型。

为了理解 SARS-CoV-2 ExoN 的底物识别和催化机制，我们构建了一个发夹 RNA 底物（以下简称 T35P31），其中包含一条模板链（T 链，也是 ExoN 的非易剪链）三个起始鸟苷，然后是 SARS-CoV-2 基因组的 3'-末端 32 个核苷酸 (nt)（不包括 poly(A) 尾）和一个 31-nt 产物链（P-链，也是易裂解的ExoN 链）以胞苷-5'-单磷酸（CMP）结尾，导致 3' 末端的 CU 错配（图 1C）。预先形成的 SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 复合物在 MgCl 2存在下消化 T35P31 RNA 底物（图 1B）。为了获得稳定的 nsp10-nsp14-RNA 复合物，我们用 MgCl 2使用重构缓冲液中的CaCl 2，或将 ExoN 活性位点突变 E191A 引入到 nsp14。两种措施都保留了 RNA 结合能力，但取消了 nsp10-nsp14 复合物的 RNA 切割活性（图 1B和图S1 和 S2）。

重组的 nsp10-nsp14-RNA 复合物通过尺寸排阻色谱 (SEC) 进行纯化，并通过单颗粒冷冻电镜进行分析。WT 和突变体 nsp10-nsp14-RNA 复合物的最终冷冻电镜图分别精制为 3.9 Å（图 S1 和 S3）和 3.4 Å（图 S2 和 S3）。除了 RNA 底物和蛋白质残基侧链构象的微小差异外，这两种结构几乎相同，所有蛋白质 Cα 原子的 RMSD 为 0.39 Å（图 S4）。ExoN 活性位点位于 nsp14 ExoN 结构域并由 nsp10 的 N 末端支持，结合 RNA 的 3' 端，将其与 5' 突出端分开（图 1D）。大多数 RNA 螺旋在溶剂暴露空间中仍可自由进入（图 1D）。

为了探索 SARS-CoV-2 RdRp 和 ExoN 之间可能的联系，SARS-CoV-2 nsp8 被包含在复合物的重构中，并被发现与 SEC 柱上的 nsp10-nsp14-RNA 复合物共洗脱（图 S1A 和 S2A）。然而，它没有与冷冻电镜样品中的 nsp10-nsp14-RNA 形成稳定的复合物，并且仅在一小部分颗粒中观察到（图 S2C），表明 nsp8 与 nsp10-nsp14-RNA 的关联复杂是弱的和动态的。尽管对 nsp8 结合类的进一步计算机分类没有产生具有 nsp8 高分辨率特征的图，但 6 Å 低通过滤图显示出沿着 RNA 双链体溶剂暴露区域的强大额外密度（图 S2C） . 当从 SARS-CoV-2 RdRp 复合结构中对接 nsp8 时 ( 20) 作为刚体进入密度，其 N 端延伸的螺旋通常很好地拟合，并且其相对于 RNA 骨架的方向与 SARS-CoV-2 RdRp 复合物 ( 20 , 21 ) 中的方向相匹配（图 S5A）。对接将 nsp8 的 C 端结构域置于冷冻电镜密度之外，但与 N 末端螺旋相邻的冷冻电镜密度未被占用（图 S5A），表明 nsp8 可能采用与处于RdRp 复合体。这与之前的结构研究一致，证明了 nsp8 ( 21 – 23）。nsp8 与 nsp10-nsp14-RNA 复合物的结合模式表明 nsp8 可能有助于稳定底物结合以进行外显子介导的 RNA 切割。事实上，外切核糖核酸酶活性测定显示 nsp8 增强了 nsp10-nsp14 复合物的 RNA 消化（图 S5B）。作为 ExoN 和 RdRp 复合物中的常见成分，nsp8 可能在两种酶之间的 RNA 底物转移中发挥作用。然而，nsp8在体内错配校正中的详细功能需要进一步研究。

使用突变 ExoN 重组的冷冻电镜样本包含一个代表 nsp10-nsp14-RNA 复合物四聚体形式的类（图 1E和图。S2C)。四聚将 3D 重建的分辨率提高到 2.5 Å，而不会影响复合物的结构（图 S2C 和 S6A）。然而，nsp10-nsp14-RNA 复合物的四聚化可能会阻止 nsp8 结合（图 S6B）。因此，在四聚体图中未观察到沿 RNA 双链体的 nsp8 样密度。尽管来自 WT nsp10-nsp14-RNA 复合物数据集的 2D 类平均值也揭示了可能代表复合物四聚体形式的粒子（图 S1B），但此类粒子的数量有限，无法进行有意义的 3D 重建。除非另有说明，我们将使用 nsp10-nsp14-RNA 复合物的四聚体形式进行 ExoN 活性位点的后续结构分析及其与 RNA 底物的相互作用，因为其分辨率更高。

与 SARS-CoV nsp10-nsp14 复合物的 apo 形式 ( 19 ) 相比，SARS-CoV-2 WT nsp10-nsp14-RNA 复合物的结构显示出 α4-α5 和 α2-α3 环的局部构象变化，导致稍微变窄的 RNA 结合袋（图 2A）。底物结合也会导致 ExoN 活性位点的完全组装。虽然 apo ExoN 仅捕获一种二价金属离子 ( 19 )，但与 RNA 结合的 ExoN 在其催化中心包含两个金属离子结合位点（图 2B和图 S7A）。金属离子 A 由 D90、E92 和 D273 的羧酸氧配位，激活水分子进行亲核攻击。金属离子 B 由 D90 和 E191 配位并稳定 –1C P的 O3' 离去基团(核苷酸编号示于图1C )(图2B和图S7A)。在 E191A 突变体 nsp10-nsp14-RNA 复合物中，由于缺少 E191 侧链羧酸盐，金属离子 B 的配位很差，并且与 –1C P的 O3' 离去基团的配位距离之外（图 2C和图2C）。 S7B)。第五催化渣油H268，其功能是作为一般碱和磷酰基转移反应过程中去质子化的催化水（24，25）（图2B和图S7A），位于nsp14α4-α5环和移位2.6埃朝向易裂解的磷酸盐，在存在 RNA 底物的情况下完成活性位点（图 2A）。

图2 SARS-CoV-2 ExoN的活性位点构象和催化机制。

( A ) SARS-CoV nsp10-nsp14 复合物（矢车菊蓝，PDB 5C8U）和 SARS-CoV-2 nsp10-nsp14-RNA 复合物（橙色）的叠加说明了 α2-α3 和 α4-α5 环的构象变化和 2.6 Å 底物结合后 H268 向 RNA 移动。( B ) SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 (WT)-RNA复合物的活性位点结构。Ca 2+离子，绿色球体；催化水，红色球体。P 链 RNA 中的核苷酸残基用下标“P”表示。+1C P、–1C P、催化水和两个活性位金属离子叠加在一起，它们的冷冻电镜密度轮廓为 10σ。( C ) SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 (E191A)-RNA复合物的活性位点结构。镁2+离子，绿色球体。+1C P、–1C P和两个活性位金属离子叠加在一起，它们的冷冻电镜密度轮廓为 7σ。

沙粒病毒科拉沙病毒 (LASV) 的核蛋白 (NP) 代表了在 RNA 病毒中发现的唯一其他外显子组 ( 14 , 15 , 26 )。尽管冠状病毒 nsp14 和沙粒病毒 NP 已经进化出不同的附加域来解决不同的功能 ( 15 )，但它们的外显子域的整体折叠和活性位点构象是相似的（图 S7、C 和 D）。主要区别在于 LASV NP 的 D466 承担了 nsp14 中 E191 的作用，以配位金属离子 B，可能是由于其较短的侧链而通过中间水分子（图 S7D）。

浅层 SARS-CoV-2 ExoN 底物结合袋仅包含 dsRNA 的碱基对 (bp)–1 和–2，通过 nsp14 中的 nsp10 和 K9、W186 和 Q245 的 A1 与 RNA 骨架相互作用（图 3A）。在dsRNA基板的3'末端，nsp14分离不匹配的一对CU和翻转+ 1U Ť出RNA双螺旋（图3，A和B）。其结果是，在SARS-CoV的-2外显子的活性位点结合是被1-nt的3'突出端，其包括+ 1C的dsRNA P（图3，A和B）中，从在其他RNA病毒中观察到的衬底结构不同和校对 DED/EDh 核酸外切酶 ( 26 – 28 ) 和先前预测的 SARS-CoV ExoN ( 8, 18 )。SARS-CoV-2 ExoN 的底物特异性是由 nsp14 和 RNA 底物之间的许多相互作用促成的（图 3，A 和 B）。SARS-CoV-2 ExoN 底物结合口袋底部的 F146 与 3' 端未配对的 +1C P堆叠在一起。N104插入到dsRNA的小沟，并建立与-1G的核苷碱基和2'-OH基团两个氢键Ť分别。H95 与未配对的 +1C P大致共面，与胞苷碱基氢键合并与 –1G T堆叠（图 3B）。H95 作为氢键供体和受体的能力可能允许它容纳所有四种类型的核苷酸，解释了 nsp14 对底物序列的相对不敏感性 ( 18 )。由于打破该碱基对所需的能量更高，SARS-CoV-2 ExoN 对 dsRNA 底物的消化可能会在 CG 碱基对处变慢。此外，位于 ExoN RNA 结合口袋边缘的 P142 与 H95 一起工作以限制 T 链侧底物结合口袋的深度，并可能迫使 RNA 底物 3'-末端的链分离CU 不匹配对（图 3，B 和 C）。用于分离错配碱基对的较低能量可以解释冠状病毒 ExoN 对 3' 端错配的 dsRNA 底物的偏好，而不是完美匹配的底物 ( 18 )。相比之下，LASV ExoN RNA 结合口袋在非易裂链侧有一个稍深的开口，因此能够容纳完全碱基配对的 dsRNA 底物（26）（图 3D）。这与其作为 dsRNA 降解免疫抑制剂的作用一致，而不是 RNA 合成校对者 ( 14 , 15 )。在光谱的另一端，是与 DNA 聚合酶相关的校对外显子，例如大肠杆菌DNA 聚合酶 III (Pol III) ε 亚基。它有一个更窄的 DNA 结合口袋，部分原因是它与 Pol III α 亚基紧密结合，并且只能适合单链 DNA 底物（27）（图 3E）。nsp14 中所有与 RNA 接触的残基在不同冠状病毒属之间都高度保守（图 S8），表明冠状病毒 ExoN 具有共享的 RNA 底物识别机制。

图3 SARS-CoV-2 ExoN识别底物的机制。

( A ) SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 ExoN 和 T35P31 RNA 骨架之间的相互作用。T链RNA中的核苷酸残基用下标“T”表示，P链RNA中的核苷酸残基用下标“P”表示。氢键和盐桥显示为灰色虚线。相互作用的核苷酸和蛋白质残基与其轮廓为 7σ 的冷冻电镜密度叠加。( B ) SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 ExoN 和 T35P31 RNA 在 +1 和 –1 核碱基位置之间的相互作用。氢键和盐桥显示为灰色虚线。π-π 堆积相互作用用绿色虚线表示。相互作用的核苷酸和蛋白质残基与其轮廓为 7σ 的冷冻电镜密度叠加。( C) SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 ExoN 底物结合口袋的表面表示显示了 T 链侧的受限开口，阻止了底物 RNA +1 位置的碱基配对。为清楚起见，未显示 nsp14 的 N7-MTase 域。( D ) LASV NP ExoN 域的表面表示。完全碱基配对的 dsRNA 底物（如图所示）结合在 LASV ExoN 的底物结合口袋中。( E )大肠杆菌DNA Pol III ExoN 复合物的表面表示。狭窄的底物结合口袋只允许 ssDNA 进入。

作为 3'-5' 外切核糖核酸酶，SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 特异性识别 3'-末端核苷酸的 2'-和 3'-OH 基团。+1C P的 2'-OH分别与 H95 和 G93 的羰基氧形成两个氢键，而核苷酸的 3'-OH 与 G93 主链氮和催化残基 E92 形成氢键（图 4A））。为了检查 3'-末端核苷酸的 2'-和 3'-OH 基团对 SARS-CoV-2 ExoN 的 RNA 切割效率的影响，我们使用 32-nt 单链 RNA (ssRNA) 进行了核酸外切酶测定底物（称为 P32 RNA）以标准核糖核苷酸或在 2' 或 3' 位置修饰的核苷酸结尾（图 4B））。SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 有效地切割未修饰的 ssRNA，尽管需要显着更高的酶浓度才能获得与在具有相同 P 链序列的 dsRNA 底物上实现的切割相当的切割（图 S9）。这可能是由于 ssRNA 与 SARS-CoV-2 ExoN 的结合较弱，这是由于 T 链侧蛋白质-RNA 相互作用的丧失导致的（图 3，A 和 B）。ExoN 接受 ssRNA 和 dsRNA 底物的能力表明体内错配校正的两种可能模式。ExoN 可能结合并切割由 RdRp 回溯导致的 P 链 RNA 的 3'-末端单链区域，如先前研究所提出的 ( 21 , 29）。或者，包含 3' 端错配的 dsRNA 底物可能会从 RdRp 上分离，随后被 ExoN 识别以进行错配切除。

图 4 抗病毒设计的结构洞察。

（A）SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 ExoN与其2'-和3'-OH基团介导的3'-末端核苷酸之间的相互作用。Mg 2+离子，绿色球体。氢键显示为灰色虚线。+1C P及其相互作用的蛋白质残基与轮廓为 7σ 的冷冻电镜密度叠加。( B ) SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 复合物对各种 P32 ssRNA 底物的裂解。在其 2'- 或 3'-OH 基团上带有不同修饰的 3'-末端 CMP 显示为白色圆圈中的黑色字母。显示了 ExoN 的浓度（以 nM 为单位）。RNA 通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 解析并通过 SYBR Gold 染色。显示了三个生物学重复的代表性结果。( C) 预测了 SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 ExoN 与单磷酸瑞德西韦 (RMP) 之间的相互作用，该相互作用以 P 链 RNA 的 3'-末端 +1 位置为模型。

在测试的酶浓度范围内，去除 3'-末端核苷酸的 2'-或 3'-OH 基团可以减少或几乎消除 SARS-CoV-2 ExoN 的核酸水解降解（图 4B），与之前的发现一致SARS-CoV ExoN ( 18 ) 并反映了 2'- 和 3'-氧在冠状病毒 ExoN 催化中的重要作用。另一方面，3'-末端胞苷的 2'-O-甲基化不会显着影响 SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 对底物的切割（图 4B），可能是因为 2'-氧之间的一些相互作用和 nsp14 被保留。

Remdesivir 是唯一获得 FDA 批准的用于治疗 COVID-19 的核苷酸类似物抗病毒药物。为了评估瑞德西韦是否可以被 SARS-CoV-2 ExoN 有效切除，我们在 P 链的 +1 位置模拟了抑制剂的掺入形式，即单磷酸瑞德西韦（RMP）（图 4C）。建模的 RMP 保留了 nsp14 和 3'-末端 CMP 之间形成的大部分有利相互作用。此外，RMP 的 1'-氰基，其延迟 RdRp 停滞活性的决定因素 ( 6 , 7 )，紧贴在 H95 和 N104 之间的空间中，并与来自两个残基的侧链氮原子形成氢键（图 4C )。这些观察结果表明，含有 RMP 的产物 RNA 可能是冠状病毒 ExoN 的底物，这与以 RMP 终止的 RNA 对 ExoN 切除没有显着抗性的发现一致（30）并且缺乏 ExoN 校对活动的冠状病毒对瑞德西韦明显更敏感（ 31 )。

我们的研究深入了解了 SARS-CoV-2 RNA 合成过程中错配校正的机制，并揭示了对 ExoN 识别和催化至关重要的底物结构特征，为特定且有效的 ExoN 抑制剂的结构引导设计提供了基础。将此类 ExoN 抑制剂与基于核苷酸类似物的病毒 RdRp 抗病毒药物共同给药可能构成对 COVID-19 的更有效治疗。此外，我们的研究揭示了 ExoN 抗性核苷酸类似物抑制剂的开发。特别是，我们表明 RNA 底物的游离 3'-OH 对于 ExoN 的核酸外切降解至关重要。已经表明，3'-脱氧核糖核苷酸可以通过来自其他正链 RNA 病毒（如 HCV 和脊髓灰质炎病毒）的 RdRp 有效地整合到新生的 RNA 中，32 , 33）。因此，3'-脱氧核苷酸类似物有可能作为有效的冠状病毒 RdRp 链终止子，也能抵抗 ExoN 切除。尽管如此，核糖环上其他位置的修饰也值得进一步探索。