交配可以启动稳定的 RNA 沉默，克服表观遗传恢复 1

抽象的

稳定的表观遗传变化并不常见，这表明这些变化通常会消失或得到修复。跨代稳定改变基因表达的变化可能需要目前未知的特定条件。在这里，我们报告说，顺式调节序列的最小组合可以支持在线虫中单拷贝转基因及其衍生物在交配时的永久 RNA 沉默。交配破坏了基于 RNA 的竞争机制，以启动可持续超过 300 代的沉默。这种稳定的沉默需要小 RNA 通路的组成部分，并且可以在反式中沉默同源序列。虽然动物不能从交配引起的沉默中恢复过来，但它们通常会从反式中恢复过来并产生抗性沉默。在大多数情况下，当双链 RNA 用于在驱动种系表达的不同调控环境中沉默相同的编码序列时，也会观察到恢复。因此，我们建议监管特征可以演变为反对对瞬态变化的永久性和潜在的适应不良反应。

介绍

当生物体通过构建自身的近似副本进行繁殖时，它们会重新创建制作另一个副本所需的信息。这种可遗传的信息被存储为基因组序列和每一代1 , 2 , 3中调节器的特定空间排列。. 因 DNA 修复失败而导致的基因组序列中的罕见突变通过每次细胞分裂期间的 DNA 复制而代代相传。与此类遗传变化不同，不改变基因组序列的表观遗传变化可导致三种可能的结果：被动稀释、通过负反馈进行主动修复或通过正反馈进行主动维护。因此，检测变化的机制和相关的监管环境都与表观遗传变化的持久性有关。

在各种系统中都观察到了持续数百代的稳定表观遗传变化。在每种情况下，它们的特点都是机制，包括复制或放大变化的正反馈。例如，在草履虫中，纤毛皮质排列的变化可以稳定，新的纤毛行使用以前的行作为模板4。在野生酵母菌中，蛋白质折叠的变化可以持续很多代，朊病毒蛋白质的折叠结构模板化了新制造的蛋白质5的折叠。在新型隐球菌中，其中祖先 DNA 甲基化的变化可能持续数百万年，甲基转移酶在 DNA 复制6时复制甲基化模式。在每种情况下，正反馈都确保祖先的表观遗传变化不会随着细胞分裂而在几代之间被稀释。

然而，单独的正反馈并不能保证跨代表观遗传变化的稳定性。例如，虽然 RNA 扩增的存在与报告的持续 RNA 沉默的案例相关，但大多数诱导沉默会在几代内消散（参见参考文献7）。在秀丽 隐杆线虫中，依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶 (RdRPs) 用于小 RNA 引导的额外小 RNA 8 的生产，这些小 RNA与末端修饰的 mRNA 片段9互补。这种小 RNA 生产循环可以跨代起作用，导致持续不同代数的影响（补充表 1）。然而，仅存在小 RNA（补充表 1）或末端修饰的 mRNA 片段9不会导致无限期的 RNA 沉默。不能用直接的父母效应解释的持续几代的变化被认为是跨代的10。这种暂时的跨代变化可能与数百代稳定的诱发变化在性质上不同。这些考虑表明，其他目前未知的招募或增强正反馈机制的因素对于稳定的表观遗传变化至关重要。

在这里，我们将交配作为一种简单的方法来重复启动可以持续数百代的单拷贝转基因的 RNA 沉默。来自该转基因的顺式调节序列的最小组合可以支持秀丽隐杆线虫种系内的这种稳定变化。共享这些调控序列子集的基因可以沉默几代，但随后会从某些形式的 RNA 沉默中恢复，甚至对某些形式的 RNA 沉默产生抗性。因此，我们的结果建立了一个范式，用于分析决定持续表观遗传变化与表观遗传恢复的调控差异。

结果交配可以通过启动 piRNA 介导的沉默来破坏基因表达

我们意外地发现，先前生成的双基因操纵子（单拷贝转基因oxSi487，参考文献11图 1a和补充图 1a）具有保持多代基因表达变化的特殊能力。这种在此称为T 的转基因编码一个双顺反子操纵子，该操纵子在种系中表达mCherry和gfp，大概是在剪接成成熟 mRNA 之前作为一个前 mRNA 转录物（图 1b和补充图 1b）。虽然继承T母体的后代表现出一致的 mCherry 和 GFP 表达，但继承尽管T在父本中稳定表达（图 1a），但T父本表现出表达缺失（图 1c，d，左）。单独交配不足以引起沉默，因为当父母双方都表达T 时，所有后代都表现出稳定的表达（图 1d，左，补充图 1c）。单独的半合子不足以引起沉默，因为从野生型雄性与表达T 的雌雄同体的杂交产生的所有半合子后代都表现出稳定的表达（补充图 1d））。这种现象不需要雌雄同体的精子，因为与转基因雄性交配的雌性化动物的杂交后代表现出沉默（补充图 1e）。我们将这种在将具有T 的雄性与雌雄同体或没有T 的雌性交配时引发的沉默称为交配诱导的沉默，因为它似乎与先前报道的表观遗传沉默现象不同（补充表 2）。尽管观察到的交配诱导沉默的程度在后代中是可变的，但它是在每个杂交中开始的，其中T仅通过父系遗传（图 1d， 正确的）。起始是非常可靠的，因为它在来自野生型、dpy或unc标记遗传背景中的 >140 个独立杂交中的每一个的 >1500 只动物中观察到。在每次比较中，都使用完全相同的标记来控制被比较动物的遗传背景。然而，根据不同遗传标记的背景，交配诱导的沉默（“昏暗”和“关闭”动物）的程度从杂交后代的 68% 到 100% 不等。由于目前尚不清楚造成这种变化的原因，因此我们没有从本研究中的小变化中做出强有力的推论。其他基因未观察到交配诱导的沉默，包括与T具有广泛序列同一性的基因（补充图 2a、b）。我们还没有发现在丰度或的RNA转录物的亚细胞定位任何显著差异Ť和易感变种Ť（补充图3A相比，这些基因不易患交配诱导的沉默（补充图的）  2C-E ）。因此，交配诱导的沉默可以在种群水平上可重复地启动，并且T对沉默的敏感性在不添加外部触发因素的情况下为诱导和分析表观遗传变化的稳定性提供了可靠的范例。

图 1：交配可以通过启动 RNA 沉默来破坏基因表达。

a单拷贝转基因Pmex-5::mCherry::h2b::tbb-2 3 ' utr::gpd-2 operon::gfp::h2b::cye-1 3 ' utr 的示意图，称为T，仅表达独立产生的最小的变体的mCherry（Tcherry），GFP（TGFP）或mCherry的缺乏piRNA基因结合位点（TcherryΔpi）和的mCherry融合到内源MEX-5编码序列（的mCherry :: MEX -5-）被描绘（顶部）。代表 L4 阶段的雌雄同体和雄性的生殖系（虚线轮廓）显示了来自T 的mCherry（洋红色）或 GFP（绿色）表达（底部）。b在表达T的动物的解剖性腺中，mCherry和gfp 的单分子荧光原位杂交 (smFISH)显示mCherry RNA 和gfp RNA 共定位为细胞核内的一个或两个点（白色箭头）。从解剖的性腺成像的代表性共焦平面（种系）。其他图像在补充图 1b 中。共定位热图表示对应的像素之间的重叠程度mCherry RNA 和gfp RNA。c半合子动物 ( T/ +)的生殖系（品红色轮廓和绿色轮廓）的量化（顶部）和代表性图像（底部）被评分为具有明亮、暗淡或不可检测（关闭）mCherry（左）或 GFP（右） ) 荧光。计算了 11 个明亮、5-8 个暗、8 个关闭（灰色）和 7 个野生型（黑色）L4 阶段雌雄同体的种系内的平均归一化荧光（红色条）。d从父母一方或双方继承T 的杂交后代雄性和雌雄同体对来自T的 mCherry 和 GFP 的表达进行评分（左）。交配诱导的T沉默独立重复的玫瑰图（正确的）。每个部分（mCherry，左和 GFP，右）代表一到四个生物学重复的独立试验，包括手稿中其他图中描述的实验数据（总共n  = 561 只动物）。虚线圆圈表示得分的动物分数的一半。e表达T、Tcherry、Tgfp、TcherryΔpi或mCherry 的动物与内源性mex-5编码序列 ( mCherry::mex-5）与非转基因动物交配，产生的杂交后代被评分为具有明亮（洋红色或绿色）、暗淡（粉红色或浅绿色）或不可检测（关闭、灰色）水平的 mCherry 或 GFP 荧光。大括号旁边的数字是指每个基因所在的染色体。所有评分的杂交后代都是雌雄同体，除了在染色体 I 上具有Tcherry的动物的情况下，其中对雄性进行评分以确保对交叉后代进行评分。在所有图中，为简单起见，纯合基因型用单个字符表示——例如，“ T ”代表纯合T/T动物，“ + ”代表非转基因或野生型 ( +/+ ) 动物等。另见补充无花果。 1– 7 . 星号表示 使用 χ 2检验P < 0.05 。显示了带有dpy标记（蓝色字体）的染色体和评分的动物数量 ( n )。比例尺，50 µm ( a , c ) 和 5 µm ( b )。源数据作为源数据文件提供。

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为了发现T对交配诱导沉默的敏感性所需的部分，我们系统地修改了T 的序列特征（补充图 3a）。所有测试的T变体都对交配诱导的沉默敏感（图 1e和补充图 1f-h），包括Tcherry，一种包含Pmex-5启动子的最小变体，通过cye-1 3' UTR驱动mCherry 的表达（图。  1E和补充图 3a中）。因此，操纵子结构、组蛋白序列、共转化标记（C. briggsae unc-119(+) ) 和基因组整合方法不足以解释对交配诱导的沉默的敏感性。在种系基因表达线虫可以依赖于3'非编码区12，13和基因组位置14。改变 3' UTR 或改变基因组位置都没有消除Tcherry对交配诱导的沉默的敏感性（图 1e，补充图 1i和 3a）。然而，当来自Tcherry 的mCherry序列在天然调控特征的背景下与内源性mex-5基因融合时，mCherry变得对交配诱导的沉默具有抗性（图 1a、e）。对沉默的抗性不能仅仅归因于内源序列的存在，因为尽管存在组蛋白h2b编码区，但T是易感的。最后，具有同源内含子序列（补充图 2a 中的Dendra2::H2B）或mex-5启动子（补充图 2a 中的mCherry var2 ::mex-5）的其他转基因对交配诱导的沉默不敏感。因此，有助于Tcherry表达的调控特征（顺式-调节序列、DNA 的核内定位、染色质邻域等）足以支持交配时基因表达的变化。

为了检查在 RNA 干扰（RNAi）15、16期间观察到的亲本因素的不平等分配是否会导致早期后代优先交配诱导的沉默，我们分别测量了四个连续后代队列中的沉默（补充图 1j）。每个队列中表现出沉默的动物比例相当，排除了这种系统性偏见。mCherry 和 GFP 荧光的变化在大多数个体 F1 动物中是相关的（补充图 1k），表明在前 mRNA 剪接期间或之后，沉默发生在未剪接的前 mRNA 上或同时发生在mCherry和gfp mRNA 上。

检查已知RNA沉默因子（补充图 3b中;参考文献9，17。）揭示配合诱导的沉默所需要的初级的Argonaute PRG-1，突变蛋白MUT-16，和二次的Argonaute HRDE-1（图 2A） ，通过喂食不依赖 PRG-1 的 RNAi 将其与沉默区分开来（补充图 3c）。四个观察结果支持使用称为 piRNA 的 PRG-1 结合小 RNA 启动交配诱导沉默的代际机制。一，来自T 的蛋白质荧光的减少伴随着沉默后代中 RNA 水平的降低（补充图 4a，b）。二、去除预测的piRNA位点18在mCherry ( Tcherry∆pi ) 中消除了交配诱导的沉默（图 1e和补充图 3d）。第三，PRG-1 的母体缺失和 HRDE-1 的合子缺失阻止了沉默的启动（图 2b）。四，使用G蛋白调节器GPR-1的母体表达防止原核融合在后代（图 2c中，d ;参考文献19，20 ;参见方法）仍然导致沉默，这表明起始独立于母体染色质的后代的生殖系。因为 PRG-1 缺失消除了T 中交配诱导的gfp沉默（图 2a，b) 并且由于Tgfp ( Pmex-5::gfp::cye-1 3 ' UTR ) 也通过交配沉默，因此与gfp 18互补的内源 piRNA 有可能触发交配诱导的gfp沉默，而与mCherry无关。总之，这些结果表明，母体 PRG-1 结合的 piRNA 使用来自T（图 2h，左）和 MUT-16 依赖性核周突变灶21 的转录物触发次级小 RNA 的产生，然后结合 HRDE-1 并导致沉默在后代。

图 2：交配诱导沉默的启动和保护要求。

a交配诱导的沉默如图1d所示 在野生型或不同突变体 ( g(-) ) 背景（左）中启动，并将产生的杂交后代中的沉默与来自对照杂交的相同基因型的沉默进行比较（右）。此处显示的野生型杂交与图1d中的相同 。具有不同可见标记的额外野生型杂交（未描绘，但显示交配诱导的沉默 - mCherry：bright = 5，dim = 6，off = 25 和 GFP：bright = 7，dim = 12，off = 17 in F1 后代）用于与右侧的rde-1(-)杂交进行比较。由于prg-1(-)交配不良，使用prg-1(-/+)亲本雄性表示父本雄性 (§)。通过仅对雄性杂交后代中的 mCherry 荧光而不是 GFP 荧光进行评分来检查mut-16在沉默起始中的要求（£）。b的要求PRG-1和HRDE-1在起始物通过配合父母突变为任一这些基因的和得分交子代测试。c测试gpr-1过表达效果的方案：gtbp-1::gfp（蓝色）雄性与野生型雌雄同体（左）或生殖系中过表达gpr-1 的雌雄同体（gpr-1 oe，右）交配。s和o分别标记通过精子和卵母细胞遗传的 DNA。代表性图像显示了gtbp-1::gfp在生殖系（顶部）和交叉后代中的头部（体细胞，底部）的分离差异。彩色轮廓和括号显示生殖系或咽部的亲本起源。d表达T∆∆∆和Pgtbp-1::gtbp-1::gfp标记(gfp) 的动物与非转基因动物或过表达gpr-1 ( gpr-1 oe ) 的动物交配。对杂交后代种系中 mCherry 的荧光进行评分。此处（顶部）和其他面板中也描述了基因结构。Ë Ť雄性与表达TcherryΔpi变体的雌雄同体交配，并对具有父系遗传T 的后代进行评分。f表达Pgtbp-1::gtbp-1::gfp标记 ( gfp ) 和Tcherry 的雄性与在野生型或gpr-1过度表达 ( gpr-1 oe ) 背景和父系遗传Tcherry荧光中表达Tcherry 的雌雄同体交配在杂交后代中得分。g T动物与pgl-1突变体交配并表达T 在半合子杂交后代和纯合子代中进行了评估。每对垂直框代表同一动物内 mCherry 和 GFP 的荧光强度。ħ原理图描述了来自交配诱导的沉默推论：左，当Ť雄性与缺乏雌雄同体交配Ť，交后代通过PRG-1通过使用了piRNA靶向卵母细胞遗传沉默的mCherry和GFP在Ť ; 中间，当T雄性与表达T片段的雌雄同体交配时，即使 piRNA 靶位点发生突变（例如Tcherry∆pi N)，保护杂交后代免受通过卵母细胞遗传的 PRG-1 引发的沉默；对，当半合子雌雄同体使用携带T 的转基因精子和缺乏T但携带靶向T 的piRNA 的卵母细胞进行自体受精时，自体后代保持未沉默，可能是由于保护性信号，可能是来自亲本T 的RNA，通过卵母细胞传递给后代。表示带有dpy标记（蓝色字体）、评分的动物数量 ( n )（a、b、d - g）和比例尺、50 µm、（c）的染色体。荧光评分如图 1 所示。 1 . 另见补充图。 1，3，4。星号表示 使用χ 2检验P < 0.05 。另请参阅方法下的“遗传杂交”。源数据作为源数据文件提供。

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总之，交配会破坏一组单拷贝转基因的表达并导致跨代 RNA 沉默。这种稳定的 RNA 沉默可能是由于促进沉默的机制的激活/获得或阻止沉默的机制的抑制/丧失，或两者兼而有之。

同源母体转录本可防止交配诱导的沉默启动

交配诱导的父系遗传T沉默的启动可以通过母系T 的表达来阻止（图 2e），这表明来自母系T的信号可以保护父系T免于沉默。一致地，保护信号映射到包含T的~3.2 Mb 区域（补充图 5a）。含有mCherry的T变体也很大程度上保留了这种保护能力（图 2e，补充图 3a和5b，c）。mCherry 的母体存在，即使与gfp的两个副本的母体存在相比，半合子单个副本可以在更多后代中保护mCherry和gfp（补充图 5b，c）。这种保护信号可以解释为什么半合子雌雄同体的半合子自体后代在多代中表现出稳定的T表达，即使通过自体精子遗传的T能够被沉默（图 2h，右，补充图 1d）。在每一代半合子雌雄同体中，转基因预计在 50% 的时间内通过自身精子遗传（补充图 1d) 并且可能需要母体保护信号来表达通过自体精子遗传的T。因此，无论是否存在通过卵母细胞遗传的保护性信号，通过卵母细胞遗传的保护性信号允许通过自体精子遗传的T在每一代中表达，或者通过自体精子遗传的T都不易受到影响。一旦父系遗传的T受到保护，T 的表达就会在自体受精产生的后代中稳定维持（补充图 5d）。尽管如此，受保护的杂交后代仍然容易受到类似于未沉默后代的引发的影响，这些后代逃脱了交配诱导的沉默的起始（补充图 5e，f）。因为尽管无义突变或缺失破坏了编码序列（补充图3a和 5b），但母系表达的T变体仍可提供保护 ，因此保护性信号可以来自T 的部分。一致地，尽管 TcherryΔpi的转录本无法结合 piRNA，但TcherryΔpi序列显示出最强的保护水平，即使TcherryΔpi编码序列的 N 端或 C 端部分被删除（图 2e）, Tcherry∆pi N/ C)。因此，保护不能用一个简单的模型来解释，即互补的母体mCherry序列与母体 piRNA 竞争。当仅使用TcherryΔpi的最后一个外显子时，保护作用很弱（补充图 5b，TcherryΔpi 外显子 4），当整个开放阅读框被删除时，保护作用被完全消除（图 2e，TΔorf）。共享相同mCherry蛋白质序列或与T区域相同的额外 DNA 序列的其他基因不能保护T（补充图 5g，h）。保护信号不要求同源染色体之间的相互作用，因为TcherryΔpi染色体II可以保护Tcherry对我染色体交配诱导的沉默（补充图 5I）。最后，防止合子原核融合仍然导致对父本T 的保护（图 2f）。总的来说，这些观察表明保护依赖于可扩散的序列特异性信号，可能是母系遗传的转录本。

我们注意到，无论突变的 piRNA 靶位点的数量如何，不同的TcherryΔpi变体似乎都与其编码序列长度成比例地提供保护（补充图 5j；也参见图 2e和补充图 5b）。这一观察结果表明，T 的变体产生不同数量的保护信号，或者母系遗传的转录本本身通过滴定掉沉默的小 RNA 来保护后代中 piRNA 结合的下游触发的T（补充图 5j，k）。Argonaute CSR-1 已被提议在促进种系基因的表达中发挥作用22，23，并且在该种系的预防或转基因沉默的逆转24，25。CSR-1 还被提议用于调节精子发生和卵子发生23，与生殖颗粒26协调沉默精子特异性转录本，并调整生殖系转录本27的水平。这些不同的角色使得 CSR-1 丢失造成的影响难以解释。此外，由csr-1突变体中染色体分离缺陷引起的胚胎致死率28使跨代的严格分析具有挑战性。尽管如此，我们检查了 CSR-1 通路的一个组件，它与这些小 RNA 相互作用，但缺乏令人困惑的发育缺陷。与 CSR-1 不同，去除尿苷酸化 CSR-1 相关小 RNA 的尿苷酰转移酶 CDE-1 会导致较少的多效性28 , 29。CDE-1 丢失并未消除保护（补充图 5l）。虽然需要额外的实验来确定介导保护免受交配诱导沉默的分子机制，但TcherryΔpi变体保护两种 mRNA 免受T 的能力表明来自T使用更复杂的机制来许可生殖系内的表达30。从piRNA基因介导的沉默种系转录物的保护可称为P颗粒相分离缩合物，其中破坏可导致误调节和一些内源性转录物的异常分布时内发生31，32。我们测试了来自T的转录物的潜在类似错误调节，并观察到在不需要交配的情况下 P 颗粒成分 PGL-1 丢失时一些动物的完全沉默（图 2g）。这一观察结果表明T 的稳定跨代表达可能反映了对来自T的转录本的可靠识别 根据一些当前的模型，在每一代中作为“自我”的一部分的 P 颗粒。

因此，交配破坏了基于 RNA 的竞争机制，这些机制调节表达以启动沉默（图 2h），并且具有部分同源性的母本转录物足以对抗 piRNA 的沉默。母体转录本的保护解释了沉默所需的交配方向，事后看来，也对我们没有观察到沉默的情况提出了解释（补充图 1l）。

交配引起的沉默被积极地维持了 > 300 代

一旦在交配后的杂交后代中建立了T的表达状态，在随后的世代中表达状态保持相似（图 3a和补充图 5m）。沉默的 F2 动物的后代在每个测试代中 100% 的动物中保持沉默超过 300 代，无需额外选择（图 3b、c、补充图 5n和 6a、b）。我们指的是携带稳定沉默的转基因副本或其变体的动物，该副本通过与i（例如iT，其中i代表不活动）在论文的其余部分。与跨代 RNA 沉默一致，iT动物的 mRNA 减少了约 30 到 37 倍，前体 mRNA 减少了约 4 到 6 倍（补充图 6c）。即使使用包含最小编码序列的T变体（补充图 5o，p），也可以检测到跨代沉默，这表明稳定的可遗传沉默不需要额外的序列特征。piRNA 引发的沉默可以持续很多代，并且与抑制性染色质修饰相关22 , 33 , 34 , 35 , 36 。. 在 RNA 沉默和染色质因子（补充图 3b）中，交配诱导沉默的跨代稳定性需要核 Argonaute HRDE-1、核苷酸转移酶 RDE-3/MUT-2 和内在无序蛋白 MUT-16，即使在 250 代之后沉默（图 3c和补充图 6d）。MUT-16 和 RDE-3/MUT-2 存在于核周病灶中，它们通过 RdRP RRF-1 和 EGO-1 21促进次级小 RNA 的产生。我们检查了单独缺乏 RRF-1 的动物和另外缺乏合子 EGO-1 的动物（因为同时缺乏母体和合子 EGO-1 的动物是不育的37 , 38）。尽管有可能挽救产妇ego-1，在rrf-1(-) ego-1(-)双突变体中恢复了微弱的 mCherry 和 GFP 表达，但在rrf-1(-)单突变体中没有恢复（图 3c），这表明这些 RdRPs 在维持在每一代人中沉默。类似地，只有hrde-1(+/-)动物的一些hrde-1(-)后代表现出表达，可能是由于母体拯救，但下一代中的所有hrde-1(-)后代都表现出表达（补充图 6d））。因此，T 的跨代沉默反映了数百代中每一代次级小 RNA 主动建立沉默，而不是通过 DNA 突变被动丢失基因表达（例如，在Neurospora中重复诱导点突变期间发生的39）。一旦在hrde-1突变体中恢复表达，恢复野生型 HRDE-1 不会重新建立沉默（补充图 6e），表明沉默信号的永久丢失。HRDE-1结合的小RNA可以识别新生转录物和招募染色质改性剂，以建立在靶基因抑制组蛋白修饰（例如，的H3K9me3）22，40。组蛋白甲基转移酶 MET-2 41、42或SET-32 42，43也不是染色质蛋白HERI-1 44被要求用于沉默（图 3C）。来自经历 > 250 代沉默的谱系的后代显示 H3K9 甲基化没有显着变化（补充图 6f，g）。虽然交配后诱导的跨代表观遗传 (TEI) 可能与其他未经检查的分子变化有关，但在没有任何相关染色质修饰的情况下，RNA 水平的降低足以解释维持（图 3c，模型）。

300 generations." data-gtm-vis-first-on-screen-10482319_399="82305" data-gtm-vis-total-visible-time-10482319_399="1300" style="margin: 0px 0px 24px; padding: 20px 10px; box-sizing: inherit; border: 5px solid rgb(213, 213, 213); max-width: 100%; clear: both;">图 3：交配诱导的沉默被积极维持了 >300 代。

a启动交配诱导的沉默，并对杂交后代及其后代的沉默进行评分。每对垂直框代表同一动物内 mCherry 和 GFP 的荧光强度（明亮、暗淡和关闭，如图1c所示 ）。b交配诱导沉默的维持通过针对mCherry外显子 RNA的 smFISH在成年T、iT（沉默约 320 代）或野生型动物的解剖性腺的指定远端区域进行测量。粉红色箭头表示远端尖端细胞的细胞核。在远端区域具有荧光或 RNA 信号中值的动物显示在代表性图像中。使用的 smFISH 探针在补充图2d中描述 . 此处显示的合并（DAPI +  mCherry RNA smFISH）图像也在补充图 6a 中显示为单独的通道，其余图像来自相同动物。图像中的数字表示每 100 µm 2的 RNA 数量以及平均值的标准误差。c左图，显示 150-250 代持续沉默的iT雌雄同体与 RNAi 基因突变体 ( g(-) ) 的雄性杂交，所得基因突变等位基因纯合子后代在 F3 ( rde-1(-) , prg-1(-) , rrf-1(-) , ego-1(-) rrf-1(-) , nrde-3(-) , hrde-1(-)), F4 ( ergo-1(-) , heri-1(-) ), F5 ( pgl-1(-) , rde-3/mut-2(-) , mut-16(-) , set-32( -) )、~F15 ( rde-8(-) ) 代，或在 F4/F6/F8 评分并合并 ( met-2(-) )。由于prg-1(-)亲本雄性交配不佳，因此使用prg-1(-/+)亲本雄性 (§)。使用可育的ego-1(−/+) rrf-1( − / − )亲本雌雄同体，而不是与iT交配的不育ego-1(-) rrf-1(-)亲本雌雄同体男性用 (#) 表示。指示使用 Cas9 介导的基因组编辑而不是遗传交叉来引入突变 (°)。右图，piRNA 介导的 RNA 沉默模型（详见正文）。沉默的评分（a，c）如图1c所示 。表示带有dpy标记（蓝色字体）、评分（c）或通过共聚焦显微镜（b）和比例尺（10 µm）成像的动物数量（n）的染色体。另见补充图。 5和6。星号表示P  < 0.05 使用χ 2检验（c）。另请参阅方法下的“遗传杂交”。源数据作为源数据文件提供。

全尺寸图片与稳定的 RNA 沉默相关的信号可以实现同源序列的反式沉默

HRDE-1 保持稳定沉默的持续要求表明，RNA 沉默可能与每一代新的小 RNA 的产生有关，这些小RNA 和/或模板RNA 是从上一代继承而来的。这种跨代作用的正反馈可能会影响同源基因的表达，因为小 RNA 可以扩散并遇到其他互补序列，可能会在这些新目标处启动沉默（图 4a）。为了测试这种可能性，我们检查了iT 的稳定沉默是否对其他同源基因有任何反式影响。我们发现通过一个配子传播的iT可以使T沉默从另一个配子继承，无论iT保持不活动的世代数如何（图 4b和补充图 7a）。此外，任何一个亲本中iT 的存在都足以在仅从另一个未沉默的亲本遗传T 的后代中引起显着沉默（图 4c）。这种反式沉默信号要么是依赖于 HRDE-1 的小 RNA，要么依赖于依赖于 HRDE-1 的小 RNA，因为它主要在合子 HRDE-1 丢失时被消除（图 4d）。虽然减数分裂在受精前在精子中完成，但它在卵母细胞的前期 I 停滞，直到受精45. 然而，卵母细胞减数分裂在单细胞受精卵的早期完成，因此当卵母细胞原核与精子原核相遇时，卵母细胞原核中仅存在单倍体基因组。通过阻止单倍体细胞核的融合，我们观察到亲本染色质之间的直接相互作用对于发生反式沉默是不必要的（图 4e），这表明反式沉默依赖于可与 DNA 分离的信号。这种与 DNA 无关的信号在通过精子传播时必须与雄性生殖系中的 DNA 分离，但当通过卵母细胞传播时，可以与雌雄同体生殖系或胚胎中的 DNA 分离。然而，这种可分离的信号在独立于iT 的一代以上无法检测到，表明它需要亲代存在iT才能生产（补充图 7b）。一旦Ť在沉默反式由智达，新近沉默拷贝Ť仍跨代沉默，即使当通过自交不祖先的拷贝传播智达（图 4F和补充图 7C）。因此，沉默依赖于每一代母系沉积的信号。这种可遗传的沉默信号可能是依赖于 HRDE-1 的小 RNA 或下游效应子，以响应不同的代际信号。

图 4：交配后的稳定沉默与可反式作用的遗传性沉默信号相关。

a示意图显示了在交配诱导的沉默时，piRNA 介导的正反馈激活以产生次级小 RNA（2° RNA）。在一个基因上产生的次级小 RNA 可能会作用于其他同源基因（反式沉默）。b表达T 的动物与保持沉默多代（iT基因编号）的iT动物交配，并对杂交后代进行评分。来自每个交叉的组合数据显示在补充图 7a 中。c T动物与非转基因或半合子iT动物交配，杂交后代只遗传了T 被得分。示意图：iT 的父母存在足以使通过其他配子遗传的T沉默，表明可分离沉默信号（灰色填充）的遗传。d hrde-1对沉默信号活性的要求通过亲本、母本和/或合子缺失 HRDE-1 进行测试。Ë Tcherry沉默了一旦配对诱导的沉默开始超过五代动物被指定为iTcherry这里。表达Tcherry和Pgtbp-1::gtbp-1::gfp标记（gfp）的雄性与iTcherry或Tcherry交配雌雄同体过表达gpr-1 ( gpr-1 oe )。在杂交后代中对父系遗传的樱桃在生殖系中的表达进行评分。f通过可分离的沉默信号或通过iT 的反式沉默对T进行了跨代评估。显示反式沉默效应的该交叉的其余结果显示在补充图 7c 中。g表达同源 ( gfp ) 或非同源 ( mCherry var，同义mCherry变体或rfp) 的雄性) 融合到普遍表达的内源性gtbp-1 的序列与非转基因或iT雌雄同体交配，GTBP-1::GFP、GTBP-1::mCherry var或 GTBP-1::RFP 的荧光在杂交后代中量化（左）。使用 Needleman-Wunsch 算法（错配的惩罚 = 0.1、间隙 = -1 和间隙延伸 = -0.2）与mCherry或显示了作为参考的T 的gfp序列（右上）。同源依赖性反式的示意图静音（右下）。有关每个成对序列比对，请参阅补充数据文件 1-6。沉默的评分（b - f）如图1c所示 。显示了带有dpy标记（蓝色字体）的染色体和评分的动物数量 ( n )。星号表示P  < 0.05 使用χ 2检验 ( b – d )、Wilson 的比例估计值 ( e ) 或双边学生t检验 ( g )，ns 表示P  > 0.05 使用相同的检验。另见补充图 7和方法下的“遗传杂交”。源数据作为源数据文件提供。

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