基因敲除大肠杆菌的代谢通量分析

大肠杆菌（又称大肠埃希氏菌）是革兰氏阴性，兼性厌氧，棒状大肠埃希氏菌，通常存在于温血生物的小肠（吸热）中。大多数的大肠杆菌菌株是无害的，但某些血清型可导致宿主食物严重中毒，有时还会因食物污染而召回产品。无害的细菌菌株是正常肠道菌群的一部分，可以通过产生维生素K2并防止病原菌在肠道内定殖而具有共生关系，从而使宿主受益。大肠杆菌通过粪便排泄。在有氧条件下，该细菌在新鲜粪便中大量生长3天，但随后缓慢减少。由于实验室培养的悠久历史和简便的操作，基因敲除细胞系大肠杆菌在现代生物工程和工业微生物学中起着重要的作用。
[82] Stanley Norman Cohen和Herbert
Boyer在大肠杆菌中的工作，利用质粒和限制酶产生重组DNA，成为生物技术的基础。

基于13C标记实验的pykF敲除大肠杆菌的代谢通量分析以及酶活性和细胞内代谢物浓度的进行了测量

基于13C标记实验的代谢通量分析，然后使用2D

NMR和GC-MS测量细胞内同位素分布，以研究丙酮酸激酶（pyk）基因敲除对连续培养的大肠杆菌代谢的影响。另外，在分批培养和连续培养中，测量16种酶的活性5种细胞内代谢物的浓度随时间变化。发现与野生型相比，在pykF突变体中通过磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸的通量被上调，并且在突变体中乙酸盐的形成显着减少。另外，在突变体中，通过磷酸果糖激酶途径的通量减少，而通过氧化戊糖磷酸（PP）途径的通量增加。这由相应的酶活性和磷酸烯醇丙酮酸，6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸酯的浓度证明。还发现对于连续培养，氧化PP和Entner-Doudoroff的酶活性。
pykF突变体的稀释度随着途径的增加而增加。为了定量地阐明新陈代谢，重要的是发现整合有关细胞内代谢通量分布，酶活性和细胞内代谢物浓度的信息。

使用CRISPR-Cas9重建涉及I-异亮氨酸双加氧酶的TCA循环以在大肠杆菌中羟化I-异亮氨酸

L-异亮氨酸双加氧酶（IDO）是铁（II）/α-酮戊二酸（α-KG）依赖性双加氧酶，可将L-异亮氨酸（I-Ile）转换为特异（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸（4-HIL）。4-HIL是用于治疗和预防1型和2型糖尿病的重要药物，但目前的方法收率低。在这项研究中，CRISPR-Cas9基因编辑系统被用于基因敲除大肠杆菌TCA循环途径中的sucAB和aceAK基因。对于单基因敲除，整个过程大约需要7天。但是，进行多轮编辑的每一轮遗传修饰时间减少了2天。使用基因组编辑的重组菌株大肠杆菌BL21（DE3）ΔsucABΔaceAK/
pET-28a（+）-ido（2Δ-ido），与大肠杆菌相比，L-Ile对4-HIL的生物转化率提高了约15％ 。大肠杆菌BL21（DE3）/
pET-28a（+）-ido
[BL21（DE3）-ido]菌株。CRISPR-Cas9编辑策略具有更快速地修饰多个基因并优化用于工业生产的菌株的潜力。

敲除qseB的CRISPR-Cas9诱导基因敲除大肠杆菌运动性和生物膜形成之间的异步

通常，细胞运动性和生物膜形成受到严格调节。

QseBC两组分系统（TCS）充当细菌信号传递的桥梁，其中QseB蛋白充当细菌运动性，生物膜形成和毒力的响应调节剂。通常，已经研究了控制QseBC及其功能之间相互作用的机制，但目前尚不清楚QseB如何调节细菌运动性和生物膜形成。在这项研究中，使用CRISPR-Cas9系统构建了大肠杆菌MG1655ΔqseB菌株（ΔqseB菌株），并确定了qseB基因对野生型（WT）运动性和生物膜形成的影响。活力测定结果表明，ΔqseB菌株比WT菌株具有更高的（p
<0.05）活力。但是，ΔqseB和WT菌株之间的生物膜形成没有差异。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因细胞敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

根据科研需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

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