一文读懂CHO-敲除细胞系

简介：

CHO细胞又称中国仓鼠卵巢细胞，是一种来源于中国仓鼠卵巢的上皮细胞系。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞以其独特的特性，已成为制备治疗性重组蛋白的主要工具。这种细胞系通常用于生物学和医学研究。同时，它也是最广泛使用的哺乳动物宿主在工业生产治疗蛋白方面。

应用程序：

基因打靶法构建基因敲除CHO细胞系

由于CHO细胞系是治疗性抗体产生的主要宿主，构建高效的CHO细胞系具有重要意义。在构建CHO细胞系中，常用的转染方法有两种，一种是随机整合法，另一种是基因靶向法。前者导致抗体产生率的变化，通常会影响转基因表达水平。

然而，在基因打靶方法中，外源基因被插入特定的染色体区域。这种方法是基于利用针对宿主细胞特定基因组区域的序列进行同源重组。研究人员利用CRISPR/Cas9系统作为基因靶向方法，通过引导RNA和Cas9诱导双链断裂，提高同源重组效率。因此，CRISPR/Cas9载体系统可以有效地将外源基因插入CHO细胞系中。

利用谷氨酰胺合成酶基因敲除细胞提高CHO细胞系的产生效率

尽管中国仓鼠卵巢（CHO）细胞以其独特的特性，已经成为制造治疗性重组蛋白的主要工具，但如何有效地鉴定这些稀有的CHO细胞系是CHO细胞系产生的主要挑战之一，在大量低产和低产无性系中的高产无性系。目前，有两种主要的CHO表达系统被广泛应用，基于二氢叶酸还原酶（DHFR）的甲氨蝶呤（MTX）选择和基于谷氨酰胺合成酶（GS）的甲硫氨酸硫氧胺（MSX）选择。

为了研究内源性GS表达对选择效率的潜在影响，采用锌指核酸酶（ZFN）技术，以内源性CHO-GS基因为靶点，构建了GS基因敲除CHOK1SV细胞株。双等位基因修饰CHO-GS基因的高效性（∼2%）支持了ZFN技术的独特优势，特别是在CHO细胞中。通过对所有GS基因敲除细胞系谷氨酰胺依赖性生长的观察，证实了GS酶功能的破坏。

谷氨酰胺合成酶介导的CHO细胞单克隆抗体筛选

利用GS基因敲除CHO细胞系12和启动子工程，即使在没有MSX1的情况下，基于GS的系统也能有效地产生细胞系。利用两个不同的宿主细胞系（CHO-K1和GS-knockout-CHO，GS-KO），在不同MSX浓度下，通过单轮筛选产生mAb的rCHO细胞克隆。

GS基因敲除CHO细胞系具有改进的选择严格性。使用GS基因敲除CHO宿主细胞系有助于在没有MSX的情况下快速产生高产克隆，降低乳酸和氨的产量。

mAb克隆产生和长期培养的生产稳定性试验流程示意图。

mAb克隆产生和长期培养的生产稳定性试验流程示意图。

CRISPR/Cas9基因敲除HEK293细胞系的策略

敲除HEK293细胞株的工作流程

Reference:

Fan
L, Kadura I, Krebs LE, Hatfield CC, Shaw MM, Frye CC, Improving the
efficiency of CHO cell line generation using glutamine synthetase gene
knockout cells.

Aga, M., Yamano, N., Kumamoto, T. et al.
Construction of a gene knockout CHO cell line using a simple gene
targeting method. BMC Proc 9, P2 (2015).

Noh, S.M.,
Shin, S. & Lee, G.M. Comprehensive characterization of glutamine
synthetase-mediated selection for the establishment of recombinant CHO
cells producing monoclonal antibodies. Sci Rep 8, 5361 (2018).

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