CRISPR/Cas四大递送方法的优劣与选择逻辑

CRISPR/Cas基因编辑系统是一种应用广泛的基因改造技术，已被应用于动物、植物与微生物等多种物种。然而，针对不同的物种，甚至同一物种的不同细胞、组织类型，我们需要根据转染对象的特征，选择合适、有效的递送方式，才能最大程度地保证递送效率。本文将以人类细胞为例，介绍近年来常见的递送方式以及其优缺点和应用场景。

一、非病毒质粒

将表达gRNA序列与Cas蛋白的质粒通过脂质体或者电穿孔等方法递送到细胞内进行瞬时表达。

优点：

1）实验操作简单快捷；

2）载体容量较大，能将gRNA与Cas序列克隆在同一个质粒进行转染以简化实验步骤；

缺点：

1）转染效率高度依赖细胞类型，部分细胞如原代细胞、干细胞转染效率低下；

2）转染试剂或电穿孔技术对细胞存活率影响较大。

应用场景：非病毒质粒易于扩增和保存，常用于易转染细胞系的基础研究、高通量筛选。

二、慢病毒

将带有慢病毒LTR序列的gRNA表达载体与Cas蛋白表达载体包装为慢病毒颗粒，感染靶细胞进行长期表达。

优点：

1）能高效感染大部分细胞类型；

2）能整合至细胞基因组内，长期、多世代稳定表达；

缺点：

1）慢病毒包装容量有限，通常需要把gRNA与Cas蛋白分别包装、感染；

2）慢病毒携带的编辑元件需要经过逆转录、整合、转录以及翻译才能表达gRNA与Cas蛋白，起效时间长；

3）整合方式为随机插入基因组，具有破坏关键基因的潜在风险；

4）对部分原代细胞、免疫细胞感染效率不高。

应用场景：慢病毒常作为难转染细胞基因编辑的补充手段。由于gRNA可在基因组水平产生可遗传的精准突变，慢病毒载体长期稳定表达的优势在CRISPR/Cas基因编辑领域已相对有限。尽管如此，利用慢病毒预先构建Cas9稳定表达细胞株仍是一种实用策略。在这些Cas9表达高度稳定的细胞系中，后续仅需瞬时转染gRNA即可高效完成基因编辑，从而显著简化实验流程、减少操作步骤并提升编辑一致性。

艾迪基因结合慢病毒系统与CRISPR/Cas技术的特性，成功构建了多种细胞系的Cas9稳定表达细胞株，为客户提供高效、稳定的基因编辑平台支持。

三、腺相关病毒（AAV）

将带有腺相关病毒ITR序列的gRNA表达克隆与Cas蛋白表达克隆包装为AAV病毒颗粒感染靶细胞。

优点：

1）免疫原性极低，是基因治疗中常用的递送手段之一；

2）不同血清型的病毒具有不同的组织嗜性，可靶向感染特定组织，再结合组织特异性启动子，可实现Cas蛋白在目标组织中的高效特异性表达；

3）以游离体的形式存在于细胞内，在低整合风险的前提下长期表达；

缺点：

1）包装容量小，Cas蛋白常选择分子量较小的SaCas9或者split-Cas9，前者由于PAM位点为NNGRRT而限制gRNA设计灵活性，而后者编辑效率相对较低；

2）在分裂细胞中会随细胞增殖分裂而逐渐稀释，导致表达持续时间缩短。

应用场景：得益于其低免疫原性与高组织特异性，AAV在动物实验和体内基因治疗中广泛应用，尤其适用于体内终末分化、不分裂的组织（如脑、眼、肝、肌肉）。

四、核酸蛋白复合物（ribonucleoprotein complex，RNP）

将gRNA oligo与Cas蛋白组合成复合体后递送到靶细胞中。

优点：

1）免疫原性低；

2）gRNA与Cas蛋白能直接作用于靶基因，起效快；

3）gRNA与Cas蛋白会在数天内被细胞代谢分解，最大程度降低整合风险与脱靶风险，是目前安全性最高的递送手段；

缺点：

1）需每次制备且流程繁琐；

2）依赖电转等递送手段，细胞毒性较大。

应用场景：RNP广泛应用于各类细胞系的基础研究，同时在体外高精度编辑领域（如临床级细胞治疗）表现出色，尤其适用于临床级细胞治疗。

总结：

与传统的基因过表达或基因敲减不同，CRISPR/Cas基因编辑即使短暂表达也能产生可遗传的稳定突变，而Cas蛋白的长期表达反而会增加脱靶风险。因此，其递送策略与传统转基因手段存在显著差异。

而在瞬时高效的递送系统中，核糖核蛋白复合物（RNP）仅由gRNA和Cas蛋白组成，无需额外载体元件或病毒系统，具有基因组整合风险低、免疫原性弱等优势，作为基因编辑递送方式备受关注。