史话Bt蛋白

引言:Bt蛋白,又叫做苏云金芽孢杆菌,这是一种存在于大自然界很长时间的菌类,20世纪初被人类发现,其一大显著优势是只针对特定昆虫有杀虫抗虫的功效,而不影响包括人在内的其他生物。因此,BT蛋白被广泛运用到各类农作物的生产中,尤其是有机农场,作为安全有效的无公害杀虫剂已经使用了近70年时间。由于转基因BT作物的出现,各类反转基因谣言中对于BT蛋白的曲解和造谣突然增多,因此,了解BT蛋白的前世今生和它的真相显得尤为重要。本文《史话BT蛋白》,力图从整个苏云金芽孢杆菌的发现历史,应用历程着手,向广大观众对BT蛋白的相关进行科普,本文原文分为上下两个部分。

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分子式

Bt蛋白基因是目前世界上应用最为广泛的抗虫基因,已经被转入多种作物中。其中,棉花、玉米、马铃薯等转 Bt 基因抗虫作物已经商业化生产,创造了可观的经济效益。

Bt不是“变态”,它是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的简称,是一种革兰氏阳性土壤芽孢杆菌,广泛存在于土壤、尘埃、水域、沙漠、 植物、昆虫尸体中。

(一)Bt的发现史

1901年,日本学者石渡繁胤(Ishiwata)从染病的蚕蛾体液中首次分离出了这种细菌,将其命名为 Bacillus Sotto。这位日本学者还发现Bt杆菌对鳞翅目昆虫有杀虫活性,但非常遗憾,菌株在当时的条件下没有保存下来。

1915年,另一位科学家Berliner分离到一种类似于Bt杆菌的细菌,他发现这种菌在芽孢形成过程中,其一端会出现小的包含物,但受当时实验的局限性,Berliner没有确定这种小包含物与杀虫活性的相关性。 

二十世纪 50 年代,人们才确定Bt 菌的杀虫活性与伴胞晶体有关。在芽孢形成过程中,苏云金杆菌会产生大量的伴胞晶体,伴胞晶体由具有高度特异性杀虫活性的结晶蛋白组成,这种蛋白通常被称为杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)或δ-内毒素或苏云金杆菌毒蛋白(Bt toxin,这里的毒仅指对昆虫有毒杀作用),即我们所谓的“Bt蛋白”。编码杀虫晶体蛋白的基因一般位于苏云金芽孢杆菌的质粒上,苏云金芽孢杆菌可以含有多种杀虫晶体蛋白基因,同种杀虫晶体蛋白基因也可以在多种不同的菌株中存在。目前人们已从不同的Bt菌的亚种中分离出对不同昆虫(如鳞翅目、鞘翅目、双翅目等)和无脊椎动物(如寄生线虫、原生动物等)有特异毒杀作用的杀虫晶体蛋白。

Bt伴胞晶体随着昆虫的摄食进入到昆虫的消化道,并释放出以原毒素形式存在的杀虫晶体蛋白,在昆虫幼虫的中肠道内,借助于蛋白酶的水解,原毒素转型为毒性多肽分子。活化了的毒素可以与敏感昆虫中肠道上皮细胞表面的特异受体相互作用,诱导细胞膜产生一些孔道,扰乱细胞的渗透平衡,并引起细胞肿胀甚至裂解,伴随着上述过程昆虫幼虫将停止进食,最终导致死亡。

具体来讲,Bt杀虫晶体蛋白的作用过程可划分为7个步骤:原毒素溶解、原毒素酶解、毒素分子穿过围食膜、毒素分子与受体的结合、毒素分子插入膜中、小孔的形成、中肠细胞失去离子平衡裂解。

Bt杀虫晶体蛋白一般为碱溶性,即需要在碱性条件下才能溶解,毒蛋白才能活化。不同昆虫的消化道的pH环境不一样,这将直接影响Bt杀虫蛋白的杀虫活性。比如Cry1-蛋白作用的鳞翅目昆虫的消化道的pH 值为10-11,在这种碱性条件下,Cry1 原毒素才能被蛋白酶降解为活性毒素。原毒素能否激活是产生毒性的首要条件。

因此,杀虫晶体蛋白能够使昆虫致死需要具备下面两个条件:1)碱性的消化道环境和蛋白酶以激活毒蛋白;2)毒蛋白与消化道上的受体发生不可逆结合。这两个条件缺一不可,同时也使得Bt蛋白具有专一性地杀死昆虫而对人和哺乳动物无害的特点。

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(二)Bt的应用史

1915年,苏云金芽孢杆菌的另一位发现者Berliner提出了用病原微生物防治农业害虫的设想。1938年,第一例商业化的Bt 杀虫剂(商品名为Sporeine)在法国被应用。

20世纪50年代,Bt杀虫剂逐渐开始在美国兴起。DNA 重组技术的发展大大促进了Bt杀虫晶体蛋白的应用。Schnepf 和Whiteley两位科学家将Bt菌库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株HD-1中的杀虫晶体蛋白基因克隆到大肠杆菌的质粒中,实现了Bt 杀虫晶体蛋白基因的第一次克隆。随后,人工重组Bt工程菌的出现,克服了用天然Bt菌生产Bt杀虫制剂效率低、成本高的缺点。至今,已经有超过200种Bt制剂在美国环保署注册。

但是,Bt制剂稳定性较差,易分解,影响了其在田间的施用效果。因此,在植物中表达Bt基因进而开发转基因抗虫作物成为了更优的选择。

1987年,第一个转Bt基因植物——转Bt基因烟草诞生,随后Bt基因被导入各类作物中。1995年,转Bt基因玉米、棉花和马铃薯3个作物首次在美国和加拿大实现了商品化。2013年,全球转Bt 作物种植面积维持在7000万公顷以上。其中,包含Bt的两种或三种复合性状的转基因作物面积为4700万公顷,占到了转基因作物总种植面积的26%。

在我国,Bt棉花的种植彻底拯救了整个棉花产业。上世纪90年代初,棉铃虫在中国棉产区爆发,由于缺乏有效的施药管理,棉铃虫对农药的耐药性极高,传统农药完全无法抑制棉铃虫的蔓延,广大农民面对绝收的棉田束手无策。1995年,在政府的引导下,转基因棉花进入863重大研究专项,开始在河北省试验种植。两年后,由于其出色的防治效果,开始在华北地区大面积推广Bt抗虫棉。20多年过去了,截至2014年,我国转Bt棉的种植面积近390万公顷,农民对Bt棉花的采用率达到93%。中国棉花种植业再也没能受到棉铃虫的侵袭。

Bt蛋白在棉花上的成功应用开始让科研人员将其尝试性地应用于其它作物,目前也取得了可观的成果。2009年,由华中农业大学自主育成的“华恢一号”和其杂交种“Bt汕优63”两个Bt抗虫水稻同时获得了农业部颁发的转基因安全证书,这一事件标志着我国的转Bt基因作物应用又向前迈进了一大步。 

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Bt蛋白基因是目前世界上应用最为广泛的抗虫基因,已经被转入多种作物中。其中,棉花、玉米、马铃薯等转 Bt 基因抗虫作物已经商业化生产,创造了可观的经济效益。Bt不是“变态”,它是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的简称,是一种革兰氏阳性土壤芽孢杆菌,广泛存在于土壤、尘埃、水域、沙漠、 植物、昆虫尸体中。

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BT蛋白被广泛运用在包括有机农业的现代农业工程中

上篇介绍了Bt蛋白的发现史及应用史,下篇介绍Bt蛋白的安全性:

(三)Bt的安全性

近年来,转基因作物的安全性已成为公众关心的焦点之一。如何对转基因作物进行安全性评价?国际上有一个广泛接受和采用的“实质等同”原则。这一原则强调,评价转基因食品安全性的目的,是评价其与非转基因同类食品比较的相对安全性,采用“实质等同”原则作“个案分析”,对转基因食品的安全性不能一概而论。目前公认:现已批准商品化生产的转基因生物生产的食品,都是安全的。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是自然界中普遍存在的一类细菌,Bt菌及Bt蛋白作为生物杀虫剂,在农业生产上也有近70年的安全使用历史。Bt作物应用已经有二十年了,期间关于Bt作物安全性的研究也非常多,但是迄今为止未有一项研究表明Bt作物具有食用安全性上的问题。

Bt蛋白能杀死昆虫却对人畜无害的特点是其蛋白特性决定的。Bt蛋白被害虫取食后,在昆虫中肠的碱性(pH10-12)条件下晶体蛋白溶解产生原毒素,在中肠内酶系统的作用下释放出活性毒素,毒素与昆虫中肠内特异受体结合进而产生毒杀作用。这一杀虫机理使得特定的Bt蛋白只对某一类昆虫有特异的毒杀作用。

而哺乳动物的胃液为强酸性(pH1-2),肠胃中不存在与Bt毒素结合的受体。当Bt蛋白进入哺乳动物肠胃后,在胃液的作用下几秒钟内就可全部降解,失去了蛋白功能。即使Bt蛋白被其他非靶标昆虫取食,虽然不能完全降解,但是由于缺少受体,也不能对那些非靶标昆虫造成毒杀。因此,多年的研究反复证实Bt毒蛋白对哺乳动物、鸟、鱼以及非靶标昆虫无害。

当然,从对环境的影响上来讲,害虫对转基因植物产生抗性是一个不容忽视的问题。

1985年,研究者首次报道了实验室条件下印度谷螟对Bt制剂产生抗性,而小菜蛾是发现的第一例在田间对Bt制剂产生抗性的昆虫。随后在实验室或田间通过人工筛选已获得了大量抗性昆虫株系。而真正在田间自然条件下对Bt作物产生抗性的昆虫是棉铃虫,抗性产生的时间发生在转基因作物开始商业化种植的6年后(2002年)。截止到2012年,田间发现的对Bt作物产生抗性的昆虫共有5类。

人工筛选抗Bt昆虫株系并揭示其抗性机理的相关研究也越来越多。这些研究不仅可以帮助我们对昆虫产生Bt抗性的潜在风险进行预测,而且可以指导我们寻找有效的方法延缓昆虫抗性的产生。目前,治理昆虫抗性的产生主要有“高剂量/庇护所”和“基因聚合”两种策略。

“高剂量/庇护所”策略被认为是一种有效的控制害虫产生抗性的策略。所谓高剂量,指转Bt作物中表达的Bt蛋白浓度足够高,能杀死全部目标昆虫。“庇护所”是指一些非转基因的作物构成的群体。目标昆虫可以在这些非转基因作物上取食,以减轻Bt蛋白对目标昆虫的选择压力。“庇护所”存在的目的是保护一定数量的敏感昆虫群体。而高剂量可以保证杀死绝大部分由抗性个体与“庇护所”中敏感个体交配产生的抗性杂合的子个体,最大可能的避免抗性基因传递给后代群体,从而延缓昆虫对Bt作物产生抗性的时间。庇护所形式可根据具体情况科学设定,比如,美国的Bt抗虫棉的种植者必须以95:5的比例采用独立的不喷施杀虫剂的庇护所或80:20的比例采用可喷施非Bt类杀虫剂庇护所;而在我国的转基因棉区,Bt抗虫棉的种植者不必单独种植非Bt棉,因棉铃虫为杂食性,可为害多种作物,这些棉区多采用多种作物混作的耕作制度,因此实际上已提供了“天然的庇护所”。

事实上,由于“庇护所”中的作物会受到害虫的侵袭,这将直接影响到种植者的利益,降低种植者的积极性。因此,研究者又提出了另一种更有利和高效的策略——“基因聚合”。

基因聚合是在同种作物品种中转入两个不同的抗虫基因,要求害虫对这两种Bt蛋白的识别存在较大差异,即不存在交互抗性。这样,昆虫同时对两种不同蛋白产生抗性的几率大大降低了。发展“基因聚合”策略对于中国的农业具有特殊的意义。由于我国的主要目标害虫、种植制度、农户规模等生态和社会环境与美国、澳大利亚等国家存在较大差异,“高剂量/庇护所”策略在我国实施困难,而“基因聚合”更符合我国的国情。

需要说明的是,害虫抗性问题不是Bt作物的专属性问题,化学杀虫剂的滥用也可以造成同样的问题。庆幸的是,多年对害虫抗性机理方面的研究已经让人们摸索出一条合适的抗性治理方案,这将极大提升Bt作物的长期利用价值。另外一方面,截至2014年,全球转基因作物的种植使得杀虫剂活性成分的使用累积减少了5.8亿公斤,共节约了1.5亿公顷土地,这极大地保护了生物多样性,对可持续发展和环境气候变化作出了杰出的贡献。

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(四)结语

随着对Bt蛋白研究的深入以及人们对转基因作物接受程度的提高,Bt抗虫作物的种植规模会越来越大,这些优良的抗虫作物的大规模种植势必会大幅度降低化学农药的田间施用量,进而在降低农业成本、释放农村劳动力、减少环境污染和提高食品品质等方面发挥更加积极的作用。 

作者: 章旺根 李晨 王萍

链接:http://www.agrogene.cn/info-3534.shtml

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