合成生物学探究真核细胞膜脂起源谜题

神秘又神奇的古菌

与细菌和真核生物相比，大多数人可能对古菌比较陌生。古菌（archaea）又可叫做古生菌、古核细胞或原细菌，之所以称为“古”菌，与其在地球上的出现时间有关。“如果将地球约46亿年的年龄比作一天的话，古菌早在凌晨5点多钟就出现了，而人类则是在深夜23点58分才诞生，因此古菌的‘古’，从某种意义上讲是这类生物在地球上出现时间很早，对极端环境适应能力最强，因此至今仍广泛分布于地球上高温热泉、盐湖、深海等各种极端环境。”

另外，古菌的神奇还体现在细胞结构上。首先，古菌具有原核生物的某些特征，如无核膜、无内膜系统以及具备环状基因组等；同时，古菌也有真核生物的特征，如以甲硫氨酸起始蛋白质的合成、核糖体对氯霉素不敏感、RNA聚合酶和真核细胞的相似、DNA具有内含子并结合组蛋白；此外古菌还具有既不同于原核细胞也不同于真核细胞的特征，如：细胞膜中的脂类是不可皂化的；细胞壁不含肽聚糖，有的以蛋白质为主，有的含杂多糖，有的类似于肽聚糖，但都不含胞壁酸、D型氨基酸和二氨基庚二酸。因此，对古菌的探究有望探究生命起源，揭开生命演化的谜团。

是“兄妹”还是“父母”？——生命树假说的争论

近年来，宏基因组技术和生物信息学的蓬勃发展加深了人类对微生物多样性、生理功能和生命演化的理解和认识。1977年，美国微生物学家Carl Woese通过16S/18S rRNA序列系统发育分析偶然发现了古菌，据此将原核生物分为两大类：细菌和古菌，与真核生物一起构成了生命起源的三域系统生命树假说（Three-Domain），换句话说，从生命树关系来看，古菌与真核生物属于“兄妹”关系。但由于缺乏合适的外群（Outgroup），生命树的根部仍未鉴别。直到1989年，Iwabe N和Gogarten JP通过对不同种类的平行同源蛋白（Paralogous protein）分析得到一个结论：生命树的根部定位在细菌和真核生物-古菌共同祖先之间。到了1990年，Carl Woese基于这个结论提出了三域生命树并将古菌划分为两个门：广古菌门（Euryarchaeota）和泉古菌门（Crenarchaeota）。

定义古细菌的Carl Woese（1928-2012）与三域假说（Three Domain Classification）

1988年，加州大学洛杉矶分校的James Lake等基于核糖体结构类似性及进化简约性分类方法，揭示了真核生物是古菌的一个分支，这也暗示了真核生物可能来源于古菌，也就是说古菌与真核生物并非“兄妹”，而是“父母”！由此提出了二域系统生命树假说（Two-Domain Classification）。

宏基因组技术的发展也促进了阿斯加德古菌(Asgard archaea)的发现。熟悉漫威电影的朋友可能知道阿斯加德是北欧神话中的神域，很多阿斯加德古菌也是以洛基（Loki）、雷神索尔（Thor）等命名。由于许多阿斯加德古菌的基因组携带大量真核标记蛋白（Eukaryotic Signature Proteins，ESP）编码基因，所以在演化关系上被认为是目前与真核生物起源距离最近的原核生物。同时，阿斯加德古菌的发现在一定程度上被认为更倾向支持二域系统生命树假说：约在18-20亿年前，Asgard谱系的古菌祖先首先获得了原始的细胞骨架系统，具有膜变形和核内体物质分选运输的能力，然后与α-变形菌门的细菌发生了“内共生”，并逐渐进化成现代真核生物中最重要的细胞系-线粒体，成为真核生物起源的关键一步，这就是著名的“内共生起源学说”。

然而，内共生学说也面临许多挑战，其中一个重要的未解之谜，是为何现存组成真核细胞与古菌细胞的细胞膜脂分子骨架具有相反的手性？现代细菌和真核细胞的膜脂主要由甘油-3-磷酸（sn-glycerol-3-phosphate，G3P）为骨架，而古菌细胞膜则以甘油-1-磷酸（sn-glycerol-1-phosphate，G1P）为基本母核结构，这一现象被称为膜脂分界（Lipid Divide）。这一现象极其不同寻常，因为组成地球生命的有机分子通常具有单一手性，如L型氨基酸、D型核苷酸等。基于内共生理论，现代真核细胞应该来源于古菌宿主，但是其细胞膜脂的手性却与古菌相反、与被内吞的细菌类似。膜脂分界和二域生命树看似存在不可调和的矛盾，这是真核起源的重大谜题之一。

合成生物学重构古菌膜脂合成通路，探究古菌-真核膜脂演化之谜（图片来源：刘陈立）

真核起源发生在距今数十亿年前，在时间旅行成为现实之前，人类无法对过去的事件进行直接观测，而传统古生物学研究主要停留在对化石的形态学分析。2022年诺贝尔生理学或医学奖授予瑞典古生物学家斯万特·帕博（Svante Pääbo），他建立了古基因组学这一全新学科，在分子水平通过古DNA基因组测序技术破解人类进化之谜。而合成生物学提供了进一步在功能层面研究古DNA遗传信息的可能性，从而探索生命起源，探究生命演化。例如，哈佛大学家乔治·丘奇George Church在其著作 Regenesis 中，对如何基于合成生物学、基因编辑等手段“复活猛犸象”的技术路径进行了展望。

在之前的研究中，科学家们基于脂质体（liposome）、细菌等构建了兼具G1P和G3P的杂合膜脂模型，但尚未成功构建真核-古菌杂合模型，以更直接地研究真核膜脂起源的问题。中国科学院深圳先进技术研究院司同课题组与南方科技大学张传伦教授课题组合作，在国际学术期刊Angewandte Chemie International Edition发表研究论文 Biosynthesis of Hybrid Neutral Lipids with Archaeal and Eukaryotic Characteristics in Engineered Saccharomyces cerevisiae。

作者依托深圳合成生物研究重大科技基础设施（以下简称合成生物“大设施”）利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为底盘，首次在酿酒酵母真核细胞中实现古菌来源极性细胞膜脂的异源合成，意外观测到兼具真核特征和古菌特征的杂合中性脂（DGGGO-FA）。通过进一步解析该类新颖化合物的合成机制，以及通过生信分析及实验表征，提出并部分验证了古菌可能合成类三酰甘油（TAG）分子用于能量储存的假说，对科学界的普遍认知提出挑战。这一研究手段将编码古菌膜脂生物合成的DNA用合成生物学的方式引入真核细胞，观测两者的膜脂是否可以稳定相融。

酿酒酵母作为实验室常用的模式真核微生物，具有详尽的遗传生化研究和丰富的合成生物学工具，是研究古菌-真核膜脂演化的理想宿主。作者依托合成生物“大设施”，采用模块化DNA组装方法，规模化构建了古菌细胞膜极性脂的生物合成通路，在酵母底盘中“即插即用”式引入产甲烷古菌(Methanosarcina acetivorans)、硫化古菌(Sulfolobus islandicusas)、Asgard古菌等不同来源的关键合成基因，成功合成了具备古菌醚键特征的极性脂，首次在真核细胞中实现了古菌来源极性细胞膜脂的异源合成。基于这一模型，作者发现酿酒酵母中竟然也具有合成G1P能力。与此同时，作者首次获得生化实验证据，支持Asgard古菌来源的GGGPS(geranylgeranyl pyrophosphate synthase)、DGGGPS ((S)-2,3-di-O-geranylgeranylglycerylphosphate synthase)酶可以合成兼具G1P、G3P手性的杂合膜脂。这些观察说明膜脂分界并非像人们原来认为的那样严格。

重组酵母中古菌特征脂类合成途径（蓝色背景）及酵母内源脂类合成途径（黄色背景）

通过对重组酵母菌株Gty-Ma进行液相色谱-质谱联用分析（LC-MS/MS）发现，重组酵母Gty-Ma脂类合成具有古菌极性脂（如下图，1-4离子峰）和中性脂分子（如下图，5、6、7、9、11、13、15蓝色背景离子峰）以及酵母内源三酰基甘油TAGs（如下图，黄色背景离子峰）。通过多种分析手段对这一系列中性脂分子的表征分析，证明了该类化合物是新颖的杂合中性脂分子DGGGO-FAs，同时含有古菌醚键特征和细菌脂肪酰基特征。基于基因敲除、回补等方法，对古菌细胞膜极性脂类合成关键酶/通路功能表征，探究了DGGGO-FAs的生物合成机制，发现酿酒酵母中二酰甘油酰基转移酶DGAT是关键合成酶，催化DGGGOH古菌醇和Acyl-CoA缩合产生DGGGO-FA。

重组酵母中古菌特征脂类合成途径（蓝色背景）及酵母内源脂类合成途径（黄色背景）

令人兴奋的是，作者在古菌蛋白数据库中开展DGAT序列同源检索，发现其同工酶序列在古菌域中广泛分布。作者选取了来源于深古菌门（Candidatus Bathyarchaeota）、广古菌门（Euryarchaeota）的DGAT序列，通过在酵母中异源表达，证明了古菌DGAT酶具有合成DGGGO-FA的能力，同时也可催化合成TAG分子。自然界中，聚羟基脂肪酸酯（PHA）、TAG及蜡酯（Wax Ester）等中性脂通常被用于能量贮存，其中真核及细菌主要利用PHA、Wax Ester和TAG、古菌主要利用PHA。因此，作者首次证明古菌中广泛存在DGAT酶（如下图所示），并通过生化实验证明其合成DGGGO-FAs的能力，有望改写科学界对古菌能量储藏形式的认知。然而，尚不清楚自然环境中古菌能否合成DGGGO-FA类中性脂，因此本研究提出的假说仍有待于进一步验证。

图DGAT同工酶在细菌、真核及古菌域中的序列相似性网络分布图

小结

总之，真核生命起源依然有许多争议和未解之谜，而合成生物学对生命起源的探究提供了新思路和新方法。本研究的局限之一是酵母模型中古菌细胞膜极性脂的含量仍然较低，未能令人信服地回答杂合细胞膜能否在真核细胞中稳定存在的问题。未来，作者计划结合代谢工程等方法，提高古菌膜脂异源合成效率，研究膜脂手性对于真核细胞生理、脂类亚细胞定位等关键生命过程的影响，持续探究真核细胞膜脂起源和演化的谜题。

中国科学院深圳先进技术研究院张建志助理研究员为第一作者，司同研究员为通讯作者。

该研究得到了国家重点研发计划（2021YFA0910800和2020YFA0908500）、国家自然科学基金（32101179, 32071428, 91851210）、海洋地球古菌组学深圳市重点实验室（ZDSYS201802081843490）和南方海洋科学与工程广东省实验室(广州)的资助，同时，也得到了深圳合成生物学创新研究院的支持。

论文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202214344

来源：中国科学院深圳先进技术研究院