交配可以启动稳定的 RNA 沉默，克服表观遗传恢复 3

转基因的命名

字母T用于指定所有遗传杂交中的转基因oxSi487。oxSi487的活性或表达等位基因命名为T，oxSi487的非活性或沉默等位基因在亲本中命名为iT。额外包含隐性标记（dpy或dpy unc）的基因型为蓝色或粉红色字体。有关所用隐性突变的详细信息，请参见补充图 3，了解T和“遗传杂交”的所有变体。

喂食 RNAi 并评分相关缺陷

RNAi 实验是在 20 °C 的线虫生长培养基板上进行的，该培养基补充有 1 mM IPTG（Omega Bio-Tek）和 25 µg/ml 羧苄青霉素（MP Biochemicals）（RNAi 板）。在所有情况下，基因型和年龄匹配的动物都被喂食对照 RNAi (L4440)，并作为对照一起评分。

单代（P0 喂养 RNAi）

该测定如先前所述进行15并用于除图6c之外的所有带有喂食 RNAi 的图中 （参见下面的“多代”）。简而言之，L4 动物被喂食针对靶基因的 dsRNA 24 小时。一些 P0 动物对表达进行评分，而其余动物在 M9 缓冲液中洗涤四次，然后在未接种的平板上爬行一个小时以去除残留的 RNAi 食物。然后将动物单独放置在 OP50 上，每 3-4 天对 6-12 只 L4 动物进行盲传，以防止饥饿并跟踪喂养后的世代。通过成像对每一代 L4 动物进行评分，并对 L4 兄弟姐妹进行传代以获得下一代的后代。在补充图8d 中执行的馈送中  和图 6b，F2 动物通过眼睛评分。

多代（P0-F2 喂养 RNAi）

多代动物 (P0-F2) 接受了 RNAi 的喂养。F1 和 F2 动物在 L4 阶段进行评分以评估 RNAi 食物的效力，并将 L4 阶段的兄弟姐妹转移到带有 RNAi 食物的新盘中以防止饥饿。与 P0 喂养 RNAi 协议类似，成人（L4 后 24 小时）用 M9 缓冲液洗涤四次以去除残留的 dsRNA，并转移到含有 OP50 的板上。然后对未处理的后代的遗传沉默效应进行评分。该测定用于图 6c。

双链RNA的表达

为了研究遗传沉默，我们从有丝分裂不稳定的染色体外阵列中表达了 dsRNA。表达数组的动物将有继承数组的后代和不继承数组的后代。我们使用了来自jamEx140 [Prgef-1::gfp-dsRNA::unc-54 3 ' UTR和Pmyo-2::DsRed::unc-54 3 ' UTR] 47 的在神经元中表达 dsRNA 和在咽部中表达 DsRed 的阵列。评估缺乏阵列的后代以测量遗传沉默，因为父母暴露于来自阵列的 dsRNA 但后代没有。该测定用于补充图 8h。

使用尼康 AZ100 显微镜成像的蠕虫阶段

除了 P0 RNAi 喂养的动物和表达oma-1::gfp或Ppie-1::gfp::PH 的动物外，在所有喂养 RNAi 实验中对 L4 阶段动物成像后对 mCherry 或 GFP 的荧光强度进行评分（图 6a和补充图 8a-f)。mCherry 或 GFP 的荧光强度在成像 L4 阶段的动物后评分 图1A，C-E ，图2a，b和d-G ，图3a，C，4B，C（通过精子信号），d-克，5，6和补充图。 1c–k、2a、b、3c、4a、5a–i、l、n–p, 6d, e , 7a–k , 8a – h (P0 动物除外)。mCherry 或 GFP 的荧光强度在 L4 阶段后 24 小时仅在图 6a 、d中表示的P0 动物和图6 中表示的动物中进行评分 。 1和E，图2a（MUT-16（ - ）动物）中，g，图4b，C（通过卵母细胞信号），图6B（P0和F2），补充图。 1a、i、5g、i、m、6d、7b、c（F2 到 F5）、h 和 i。在图4e和补充图 7c 中表示的 L4 阶段后 48 小时，对 mCherry 或 GFP 的荧光强度进行评分  （仅限 F1）。

基因杂交

三个 L4 雌雄同体和 7-13 只雄性被放置在同一块板上，并允许在每个交叉板上交配。在交叉板建立后 3-5 天分析交叉后代。每个杂交至少建立两个独立的交配。对于图4f 中的十字架 （仅限 F1s），补充图。 5a、c（仅与Mos1/+杂交）、h、m、n、7c（仅 F1s），在对所有动物进行评分后，通过 PCR（引物 P1、P2 和 P3）确定所需的基因型，并且仅来自动物的数据用正确的基因型作图。在无花果。 1c-e、2a、b、g、3c、4b-d、5b和补充图。 1c, d, j, k, 2a , 5a, d–g , 6d, e , 7a, b, d–i , dpy-2(e8) (~3 cM from oxSi487 ) 被用作链接标记或平衡器来确定T的基因型。在无花果。 1e、2a、f、3a、4e、f、5b和补充图。 1f–h , 3d , 5a–d , i, o, p , 7c, j, k , dpy-10(-) (~7 cM from oxSi487 ) 用作链接标记或平衡器来确定T的基因型. 在补充图中。 图 2a、5d、e、h、unc-8(e49) dpy-20(e1282)用作连锁标记或平衡器来确定ax2053的基因型。在补充图 5a 中，unc-4(e120)（来自oxSi487 的~1.5 cM ）被用作连接标记或平衡器来确定T的基因型。在图 2a右侧（rde-1(-) 的对照）中，dpy-17(e164) unc-32(e189)用作标记以促进杂交后代的鉴定。一些杂交还需要通过对单个蠕虫进行基因分型来鉴定杂交后代，包括图 1 和图 2 中的那些。 2b, 克, 3c (对于ego-1(-) rrf-1(-) ), 4d , 补充图。 5a、c（仅Mos1/+）、h、l、6d、e、7c、f、g。与T杂交的动物；PRG-1（+/-）雄性在图 2b中顶部或3 c同样也基因分型以确定T / + ; prg-1(-/ - )或T; prg-1( − / − )分别交叉后代。在补充图中的十字架中。 5f, h , 7f，i（对照杂交），所需基因型的杂交后代分别通过咽部 mCherry 或 GFP 47的不存在或存在来鉴定。对起始（图2）和维持（图 3）要求进行分析的所有菌株 至少已突变两代，除了在起始时测试对prg-1(-)的要求时，这是使用prg-1( - ）的是分别为突变体用于一次生成或动物自我-1（ - ）中的维护，其使用进行自我-1（+ / - ）的父母。

与 mut-16 突变体的遗传杂交以测试交配诱导沉默的启动

在图 2a 中，L4 雄性杂交后代仅对 mCherry 荧光进行评分，因为由于肠道自发荧光，在 L4 雄性生殖系的单个性腺臂中难以评估 GFP 荧光。

遗传杂交以确定在重新引入野生型 hrde-1 后是否会失去去除野生型 hrde-1 后的表达恢复

在补充图 6e 中，hrde-1(-)突变雄性与保持沉默约 270 代的iT雌雄同体交配，导致杂交后代 (F1) 可以产生不同基因型 (F2) 的自体后代，其中T纯合子和野生型或hrde-1突变等位基因的纯合动物通过传代自体后代（F3 到 F7）进行评估。另外，每一代hrde-1(-)；Ť通过自体受精（F2至F6）中产生雌雄同体交配被用野生型（+ / +）或HRDE-1（ - ）男性检查重新启动跨代沉默的可能性。mCherry 和 GFP 荧光在杂合 F1 杂交后代 ( hrde-1( - /+) ) 和 F3 或所描述基因型的后续后代中进行评分。F2 hrde-1(-)的杂交后代（灰色文本）；Ť尽管多种生物学重复由于实验设计不能得到与野生型雄性交配雌雄同体。具体来说，交配是在单个hrde-1(-)之间重复设置的；牛逼雌雄同体有三个野生型男性在每一代人，从F2代开始起。hrde-1(-)的雌雄同体的选择；T基因型仅从 F3 代成功，因为纯合子hrde-1(-); T只能从F2代开始建立，这是后代基因型可以成为hrde-1(-)的第一代；T后交叉设于 P0。结果，F2 hrde-1(-); Ť需要有雌雄同体杂交为，但它们不能从它们的区别HRDE-1（+）; Ť或HRDE-1（+ / - ）; F1 > F2 板上的T兄弟姐妹。确定所用雌雄同体基因型的唯一方法是首先将未知hrde-1的单个随机雌雄同体交配基因型与三个野生型雄性，然后允许 F3 后代在牺牲 F2 雌雄同体进行基因分型之前放置 3 天。然而，此时，F2 雌雄同体的受精囊中将含有野生型精子，这可能会混淆基因分型 PCR。

使用过表达 gpr-1 的动物进行遗传杂交

为了分析DNA无关的信号，我们使用了最近开发的工具，其防止父系和从受精卵内熔化母体前核19，20。AG 蛋白调节剂 GPR-1 在母系过度表达时，会增加拉动纺锤体极的力，并防止母本和父本细胞核融合。这使得父系细胞核的内容只能遗传到 P 谱系的细胞中，而母体细胞核的内容只能遗传到 AB 谱系的细胞中。通过大多数交叉后代中的这种非孟德尔分离，父本 DNA 遗传到所有生殖细胞和选择体细胞（如肠和体壁肌肉），而母本 DNA 仅遗传到体细胞中（图 2d））。一小部分后代要么在生殖系和一些体细胞中具有母本 DNA，在大多数体细胞中具有父本 DNA（图 2d），要么在所有细胞中与父本和母本 DNA 进行孟德尔分离（数据未显示）。为了分析该工具在我们手中的稳健性，我们使用gtbp-1::gfp测试了父本和母本 DNA 的分离，其在所有组织中表达细胞质 GFP（图 2d）。当过度表达gpr-1 ( gpr-1 oe ) 的雌雄同体与携带gtbp-1::gfp 的雄性杂交时, > 95% 的杂交后代表现出非孟德尔分离，父系 DNA 遗传到 P 谱系细胞（基于生殖系中存在 GFP）和母体 DNA 遗传到 AB 谱系细胞（基于某些咽部不存在 GFP细胞和神经元）。数量少得多的杂交后代 (<5%) 表现出反向分离模式或孟德尔分离模式。我们使用gtbp-1::gfp作为标记来识别与gpr-1 oe进一步杂交的非孟德尔杂交后代。为了分析亲本信号对生殖系中T 的影响，我们必须确保T（以及伴随的标记基因，gtbp-1::gfp) 总是从男性遗传，因为大多数非孟德尔杂交后代会将父系 DNA 遗传到生殖系中。由于表达gpr-1的转基因也表达了gfp的同义变体，我们使用了T的变体，即T∆∆∆或Tcherry进行进一步分析，以避免来自两个不同来源的 GFP 荧光，混淆解释。

与Pmex-5::Tcherry::mex-5 3'utr和Pmex-5::Tcherry::tbb-2 3'utr 的遗传杂交

MosSCI将Pmex-5::Tcherry::mex-5 3 ' utr和Pmex-5::Tcherry::tbb-2 3 ' utr整合到基因组中导致转基因的自发沉默22，其表达可以恢复通过hrde-1的突变。因为亲本hrde-1是可有可无的，合子hrde-1足以启动交配诱导的沉默（图 2b），我们使用Pmex-5::Tcherry::mex-5 3 ' utr；hrde-1(-)或Pmex-5::Tcherry::tbb-2 3 ' utr; hrde-1(-)相互交叉的亲本动物以测试交配诱导的沉默（补充图 1i）。这些杂交产生了基因型Pmex-5::Tcherry::mex-5 3 ' utr 的杂交后代；hrde-1(+/-)或Pmex-5::Tcherry::tbb-2 3 ′ utr; HRDE-1（+ / - ），分别，然后将其计分配合诱导的沉默。

iT和iTΔ菌株的生成和维持

为了使具有与dpy标记相连的iT 的雌雄同体，AMJ581 雌雄同体与 N2 雄性交配以产生杂交后代雄性，它们都显示来自oxSi487 的明亮 mCherry 荧光。然后将这些雄性与 N2 雌雄同体交配以产生具有无法检测到的 mCherry 荧光的杂交后代 (F1)。F1 动物被允许产生oxSi487纯合子的后代 (F2)，这由连锁dpy-2(e8)突变的纯合性确定。一种这样的 F2 动物被分离出来作为iT菌株 (AMJ692)进行繁殖。

为了制造具有iT 的雄性，dpy-17(e164) unc-32(e189)雌雄同体与 EG6787 雄性交配以产生具有不可检测的 mCherry 荧光的杂交后代 (F1) 雌雄同体。允许这些杂交后代具有与oxSi487纯合的自身后代(F2) 。两个这样的 F2 被分离出来作为两个不同的iT系进行传播。其中之一被指定为 AMJ724 并用于进一步的实验。这些菌株保持oxSi487的沉默，并进行热休克以产生雄性。使用 PCR 验证iT菌株的基因型。

为了使iT∆连接到dpy标记的雌雄同体，AMJ767 雌雄同体与 N2 雄性交配以产生具有明亮 mCherry 荧光的杂交后代雄性。然后将这些雄性与 GE1708 雌雄同体交配以产生具有无法检测到的 mCherry 荧光的杂交后代 (F1)。F1允许动物给予纯合的后代TΔ通过基因分型确定jamSi20。分离出一个纯合子代作为iTΔ菌株 (AMJ917)进行繁殖。使用 PCR 验证iTΔ菌株的基因型。

AMJ692 被用来测试基因表达的恢复，大约 150 代。这一代时间估计如下：在 556 天的时间里，蠕虫每 3.5 天传代一次，共传代 143 代，除了允许它们饥饿的三个间隔和饥饿后恢复幼虫的间隔。这些从饥饿中恢复的间隔在 49 天内总共跨越了约 6 代。因此，总代数 = 143 + ~6 = ~150 代。其他iT菌株 AMJ724、AMJ552 和 AMJ844的世代时间也进行了类似的估计。沉默超过 150 代的iT菌株用于测试维持跨代沉默对 RNAi 因子的要求。

CRISPR-Cas9 介导的oxSi487编辑

为了在oxSi487 中生成编辑，基于 Cas9 的基因组编辑与共转换策略62被使用。使用补充表 5 中列出的引物从 pYC13 扩增向导 RNA。纯化扩增的向导（PCR 纯化试剂盒，Qiagen）并在体外测试切割效率（Cas9，新英格兰生物实验室目录号 M0386S）。对于大多数编辑，修复的同源模板（修复模板）是使用 Phusion 高保真聚合酶（新英格兰生物实验室目录号 M0530S）和基因特异性引物从 gDNA 制成的，以分别扩增待编辑位点上游和下游的区域。将两种 PCR 产物用作模板以使用 Phusion 高保真聚合酶生成整个修复模板，并使用 NucleoSpin Gel 和 PCR Clean-up（Macherey-Nagel，目录号 740609.250）纯化融合产物。同源模板生成T∆∆和dpy-10(-)是单链 DNA 寡核苷酸。向野生型动物注射 0.12–12.9 pmol/µl 向导 RNA、0.08–1.53 pmol/µl 同源修复模板以在T和dpy-10和 1.6 pmol/µl Cas9 蛋白（PNA Bio 目录编号）中进行编辑.CP01）。在T∆∆编辑的动物中，由于 EG6787背景中的unc-119(ed3)突变，Punc-119缺失导致 Unc 动物，这表明功能性转录本不是由拯救Punc-119的剩余部分制成的::unc-119::unc-119 3 ' utr插入到ttTi5605. 使用 PCR 和 Sanger 测序验证编辑。有关特定试剂的其他详细信息，请参阅补充表 5。

CRISPR-Cas9 介导的插入

为了生成大插入，基于 Cas9 的编辑协议改编自参考文献。63 . 将以下混合物注射到 HT1593 动物中：42–55 ng/µl 质粒，表达 Cas9 蛋白和 sgRNA 序列，该序列特异于ttTi5605(pDD122)附近的染色体 II 位点或ttTi4348 (pSD18)附近的染色体 I 位点，105 ng/µl 的 pMA122 ( Phsp -16.41::peel-1::tbb-2utr ), 42–55 ng/µl 修复质粒，用于插入Tcherry Crispr ( jamSi38, jamSi40, jamSi41 ) 或Tcherry I ( jamSi56 )）。注射后，将动物挑出并让平板拥挤直至饥饿。饥饿的平板在 34°C 下热休克 2.5-4 小时，让热休克动物过夜恢复。在热休克中幸存下来的非 Unc 动物被挑选出来，繁殖并使用 PCR 筛选编辑。然后在提取基因组 DNA 后筛选出编辑阳性的分离株中验证单拷贝插入。

Mos 介导的单拷贝插入 (MosSCI)

为了生成大插入，MosSCI 协议改编自参考文献。11 . 将以下混合物注射到 EG4322 动物中：50–55 ng/µl 表达 Mos1 转座酶的质粒（pCFJ601：Peft-3::mos1 转座酶::tbb-2utr），105 ng/µl pMA122（Phsp-16.41::peel- 1::tbb-2utr )，50–55 ng/µl 修复质粒，用于将Tcherry、Tgfp、TcherryΔpi、Tcherry::tbb-2 3 ' utr或Tcherry::mex-5 3 ' utr插入染色体 II ttTi5605附近插入部位。注射后，将动物挑出并让平板拥挤直至饥饿。饥饿的平板在 34°C 下热休克 2.5-4 小时，让热休克动物过夜恢复。在热休克中幸存下来的非 Unc 动物被挑选出来，繁殖并使用 PCR 筛选编辑。然后在提取基因组 DNA 后筛选出编辑阳性的分离株中验证单拷贝插入。

定量 RT-PCR (RT-qPCR)

使用 TRIzol (Fisher Scientific) 从 50 至 100 µl 混合阶段动物颗粒中分离总 RNA。通过从相同菌株的三个不同平板中造粒动物来分离三个生物学重复。用氯仿抽提RNA，用异丙醇沉淀，用乙醇洗涤并重悬于20-30 µl 无核酸酶水中。留出 2–5 µl 重悬的 RNA 以在凝胶上运行，剩余的在 DNase 缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 8.5、5 mM CaCl 2、25 mM MgCl 2)，并与 0.25 µl DNase I（新英格兰生物实验室，2 单位/µl）在 37 °C 下孵育 60 分钟，然后在 75 °C 下加热灭活 10 分钟。在 1% 琼脂糖凝胶上运行 DNase 前和后处理的 RNA，以检查是否存在 rRNA 条带。测量 RNA 浓度，并使用 SuperScript III 逆转录酶（Invitrogen 目录号 18080044）将等量（500–5000 ng）的 RNA 转化为 cDNA，与制造商的建议相比，数量减少了两倍。对于 cDNA 转化，每个样品的每个生物学重复进行 3-5 次技术重复，RT 引物 P82 用于R11A8.1，P176用于tbb-2前体 mRNA，P177用于 tbb-2 mRNA，P83用于mCherry前体用于mCherry 的mRNA P84基因，P78的GFP前体mRNA和P85的GFP表达。使用 cDNA 作为模板并根据制造商的建议使用 LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix（罗氏目录号 4707516001）指南进行 PCR。对于pre-mRNA的分析，引物P86和P87用于R11A8.1，P88和P89用于tbb-2，P93和P179用于mCherry，P96和P97用于gfp。对于 mRNA 的分析，引物 P94 和 P95 用于tbb-2，P90 和 P91 用于mCherry，P98 和 P99 用于gfp。使用 2 -Ct计算倍数变化 值和样品被归一化为总 RNA。

通常测量三个（补充图 2c）到六个（补充图 6c）独立的生物重复，每个生物重复是三到五个技术重复的中位数。缩放散点图用于描述每个生物复制的前 mRNA 和 mRNA 的相对丰度。RNA 丰度被估计为与 2 -Ct成正比，并且目标转录物被标准化为总 RNA 以获得相对丰度。

染色质免疫沉淀-qPCR (ChIP-qPCR)

该协议改编自参考文献。64每个 ChIP 实验使用 300–500 μl 冷冻混合阶段蠕虫颗粒。每个菌株进行三个生物学重复，每个样品中的蠕虫被分成 100 µl 颗粒。通过用研钵和研杵研磨来粉碎冷冻颗粒。将粉碎的沉淀物重新悬浮在 1 ml 缓冲液 A（15 mM HEPES-Na，pH 7.5、60 mM KCl、15 mM NaCl、0.15 mM β-巯基乙醇（CALBIOCHEM 目录号 444203）、0.15 mM 精胺（Sigma-Aldrich 目录号S3256-1G)、0.15 mM 亚精胺（Sigma-Aldrich 目录号 S2626-1G）、0.34 M 蔗糖、1X HALT 蛋白酶（ThermoScientific 目录号 78440）和磷酸酶抑制剂混合物（ThermoScientific 目录号））。为了交联，添加甲醛至终浓度为 2%，并在室温下孵育 15 分钟。通过添加 0.1 ml 1 M Tris HCl (pH 8. 0）。裂解液以 15,000 × g在 4°C 下保持 1 分钟。通过在洗涤之间离心，用冰冷的缓冲液A洗涤所得沉淀物两次。将沉淀物重新悬浮在含有 2 mM CaCl 2 的0.3 ml 缓冲液 A 中。加入微球菌核酸酶（Roche 目录号 M0247S）至终浓度为 0.3 U/μl，并在 37°C 下孵育 5 分钟（每分钟将管倒转数次）。加入终浓度为 20 mM 的 EGTA 以停止消化反应，并将样品以 15,000 × g离心 在 4 °C 下 1 分钟，然后用 300 µl 冰冷的 RIPA 缓冲液（1X PBS、1% NP40（光谱目录号 T1279）、0.5% 脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich 目录号 D6750）洗涤所得沉淀-10G)、0.1% SDS、1X HALT 蛋白酶和磷酸酶抑制剂以及 2 mM EGTA（Sigma-Aldrich 目录号 E3889-10G））。样品在 4 °C 下以 15,000 × g离心 1 分钟。在 0.8 ml 冰冷的 RIPA 缓冲液中洗涤后重新悬浮沉淀，并使用 Covaris 65剪切溶解。除了剪切期间，样品一直保持在冰上。将每个生物复制的所有剪切裂解物合并并均分以沉淀所有被测量的染色质标记。剪切裂解物以 15,000 × g离心 2 分钟。将 80 μl 上清液在 -20 °C 下留作“输入”文库，剩余的上清液用于 IP。抗体是根据它们在秀丽隐杆线虫66 中的效率来选择的. 2 μg 抗 H3 抗体（Abcam，ab1791）、3 μg 抗 H3K9me1 抗体（Abcam，ab8896）、3 μg 抗 H3K9me2 抗体（Abcam，ab1220）或 2 μg 抗 H3K9me3 抗体（Abcam）之一, ab8898) 加入并在 4 °C 下轻轻搅拌过夜。添加 50 μl 蛋白 A Dynabeads（1x PBS 缓冲液中的 10% 浆液）并通过在 4°C 下振荡 2 小时来混合。然后用冰冷的 600 μl LiCl 洗涤缓冲液（100 mM Tris HCl，pH 8、500 mM LiCl、1% NP-40、1% 脱氧胆酸钠）将珠洗涤四次（4 分钟/洗涤）。使用磁性支架（DynaMag-2 Magnet，Thermo Scientific）对珠子进行沉淀，每次洗涤后弃去上清液。珠子和输入物与 450 μl 蠕虫裂解缓冲液（0.1 M Tris HCl，pH 8，100 mM NaCl，含有 200 μg/ml 蛋白酶 K 的 1% SDS）在 65 °C 下持续 4 小时，每 30 分钟搅拌一次，以洗脱免疫沉淀的核小体和反向交联。通过有机提取和沉淀分离DNA。根据制造商的建议，使用 LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix 通过 qPCR 测量获得的 DNA（有关详细信息，请参阅 qRT-PCR 方法的 PCR 部分和前 mRNA，或等效的 DNA，引物）R11A8.1、mCherry和gfp）。使用 2 -ΔΔCt方法计算倍数变化，并将样品标准化为免疫共沉淀对照基因R11A8.1。

单分子荧光原位杂交 (smFISH)

定制的 Stellaris FISH 探针仅针对来自oxSi487的mCherry和gfp序列的外显子设计，使用来自 Biosearch Technologies 的基于网络的 Stellaris FISH 探针设计器 ( www.biosearchtech.com/stellarisdesigner )。避免了预期跨越外显子-外显子连接的任何探针设计，以允许对成熟和新生转录物的等效检测。标准线虫smFISH 协议后跟 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色如所述使用67 , 68。用于检测mCherry的探针混合物包括 25 个外显子特异性探针（P112 到 P136），每个探针都用 Quasar 670 染料和反义标记mCherryRNA。用于检测gfp的探针混合物包括 26 个外显子特异性探针（P137 到 P162），每个探针都用 Quasar 670 染料和gfp RNA反义标记。调整后的 smFISH 方案如下：50-100 只 L4 动物或成年动物在 L4 后~24 小时（图 3b，补充图 2e、4b、6a）在 400 µl 1X 磷酸盐缓冲盐水 0.1% Tween-20（ PBST，Amresco，目录号 C999G23 K875-500ML）含有 0.25 mM 左旋咪唑，用于解剖或小于 L4 的整个动物（补充图 4b）) 在 1X PBST 中洗涤并在室温下固定在 1X PBST 上的 1ml 固定溶液（3.7% 甲醛（Amresco，目录号 0493-500 ML）在 1X PBST 中）中。不同试验的固定时间介于 15 到 45 分钟之间。样品在 1X PBST 中洗涤，在透化溶液中孵育 10 分钟（0.1% Triton X-100 在 1 ml 1X Gibco PBS pH 7.4（Thermofisher Scientific，目录号 10010023）中），在 PBST 中洗涤两次并重悬于 1 ml 70 % 乙醇并在 4°C 下孵育 1 至 7 天。然后平衡固定的动物并用洗涤缓冲液（2X 柠檬酸钠（SSC，Sigma Aldrich，目录号 11666681001）、10% 甲酰胺（Millipore Sigma，目录号 4650-500 ML 或 Amresco，目录号 0314-500 ML）洗涤， 0.01% Tween-20（Fisher Scientific，目录号 BP337-100））与 0 杂交。025 µM 探针在杂交缓冲液（10% 硫酸葡聚糖（Sigma Aldrich，目录号 D8906-5G）、2X SSC、10% 甲酰胺）中在 37°C 旋转器中在黑暗中稀释 48 小时。然后在洗涤缓冲液中洗涤杂交动物，用 DAPI 溶液（洗涤缓冲液中的 1 μg/ml DAPI）避光孵育 30-120 分钟，在旋转器中在洗涤缓冲液中洗涤两次，每次 5 分钟并用于安装。将蠕虫重新悬浮并在室温下孵育 5 分钟或在 4°C 下在不含酶的 GLOX 缓冲液（2X SSC，1% 葡萄糖（Fisher Scientific，目录号 D16-500），0.1 M Tris pH 8.0（ Thermofisher Scientific，目录号 AM9855G）在无 RNase 水中），用新鲜制备的 GLOX 酶缓冲液（100 μl GLOX 缓冲液，1 μl 葡萄糖氧化酶（MP Biomedicals/Fisher Scientific，目录号 0219519610），3.7 mg/ml，1 μl 过氧化氢酶（Fisher Scientific，目录号 S25239A），1 μl 200 mM Trolox（Acros Organics/Fisher Scientific，目录号 218940050））并通过将样品滴在盖玻片上然后放置并密封在显微镜载玻片上准备成像凡士林、羊毛脂和石蜡的混合物。单个实验组内的所有样品均包括对照菌株，并经受相同条件（例如孵育时间）以最小化实验内的变异性。所有 smFISH 实验均使用无 RNase 条件。单个实验组内的所有样品均包括对照菌株，并经受相同条件（例如孵育时间）以最小化实验内的变异性。所有 smFISH 实验均使用无 RNase 条件。单个实验组内的所有样品均包括对照菌株，并经受相同条件（例如孵育时间）以最小化实验内的变异性。所有 smFISH 实验均使用无 RNase 条件。

AMJ1259、AMJ1260 和 AMJ1261 雌性与 AMJ1045 或 EG6787 雄性交配，并且在 L4 后约 24 小时分期的交叉后代雌雄同体的挤压性腺使用mCherry探针进行 smFISH 协议（补充图 4b）。对于补充图 6a、b，EG6787（“ T ”）、AMJ552（“ iT ”）和 N2（“野生型”）成年雌雄同体在 L4 后约 24 小时上演的挤压性腺使用 smFISH 协议进行mCherry或gfp探针。对于补充图 2e顶行，在 L4 后约 24 小时分期的 EG6787、AMJ1170、JH3323 和 N2 成年雌雄同体的挤压性腺使用mCherry单独探测。对于补充图 2e底行，在 L4 后约 24 小时上演的 EG6787、AMJ1195、JH3197 和 N2 成年雌雄同体的挤压性腺仅使用gfp探针进行 smFISH 协议。

共聚焦显微镜对单分子 RNA 信号或蛋白质荧光进行成像

图像是使用 Leica SP5 共聚焦显微镜和 ×63 油浸物镜以 500% 数字变焦拍摄 smFISH 样品和 400% 数字变焦拍摄蛋白质荧光。在对应于解剖性腺的远端、环或近端区域的区域捕获了一个 0.5 µm 厚的共焦切片。对于在大多数解剖的性腺中成像的所有三个区域，Z 位置被定向为与远端尖端细胞的细胞核相同的平面。为了对 smFISH 的 L2 和 L3 阶段之间的整个蠕虫进行成像，以 0.5-1 的步长对可以在与解剖性腺相同的放大倍数下容纳在视野内的部分生殖系的 Z 堆栈进行成像µm 并显示为最大强度投影。明场和 DAPI 图像是使用光电倍增管拍摄的，而mCherry和gfp RNA 和蛋白质荧光图像是使用混合检测器 (HyD) 拍摄的。对于 smFISH 和蛋白质荧光，XY 激光扫描设置为 400 Hz，并以 1024 × 1024 像素的分辨率成像。Quasar 670 探针使用 Alexa 633 nm 激光（50% 白光激光）激发，在 650 到 715 nm 之间检测到信号，针孔为 105.05 µm。DAPI 使用 405 nm（3–30% 紫外激光）激发，在 422 到 481 nm 之间采集信号，针孔为 95.52 µm。对于 Quasar 670 和 mCherry 或 GFP 蛋白荧光，使用 6-8 线平均值和 1-2 帧累积。对于 DAPI，使用 3-4 行平均值。

沉默的量化和荧光强度的测量

为了对成像后的荧光强度进行分类，在使用 3 mM 左旋咪唑（Sigma-Aldrich，Cat# 196142）使蠕虫麻痹后，将 L4 阶段或 L4 阶段后 24 小时的动物安装在载玻片上，在非饱和条件下成像（尼康） AZ100 显微镜和 Photometrics Cool SNAP HQ 2相机），并分为三组 - 明亮、暗淡和关闭。C-HGFI Intensilight Hg Illuminator 用于激发 GFP 或 Dendra2（滤光立方：450-490 nm 激发、495 二向色性和 500-550 nm 发射）或 mCherry 或 RFP（滤光立方：530-560 nm 激发、570二向色和 590-650 nm 发射）。检查未被肠道自发荧光遮蔽的性腺切片，以对来自oxSi487 的GFP 和 mCherry 荧光进行分类. 在对 GFP 或 Dendra2 进行成像时，自发荧光很明显，但在对 mCherry 进行成像时则不然。

在某些情况下，在图6c和补充图8h 中的 L4 阶段或补充图中 的 L4 阶段后 24 小时，在没有成像的情况下通过眼睛对种系内的荧光强度进行评分 。 5e、f（寻找明亮的男性 F1s）、7b（寻找男性 F1s）和8a在固定放大倍数和变焦下使用 Olympus MVX10 荧光显微镜无成像。

为了定量测量来自使用 Nikon AZ100 成像的T的 mCherry 和 GFP 的蛋白质荧光（图 1c）和来自其他转基因的蛋白质荧光（图 4g、5b左图和补充图 8a-f），感兴趣区域（ROI） ) 使用 NIS 元素或 ImageJ (NIH) 进行标记，并测量强度。从每个图像的测量强度中减去背景。对于无花果。 1c、4g、5b和补充图 8a-f，荧光强度测量为 x - b，其中 x = ROI 的平均强度，b = 背景的平均强度。将获得的强度值转换为 log 2标度并作图。

在喂食 RNAi 的实验中，每个菌株的靶基因 ( gfp ) 和对照 RNAi 喂养的动物在相同的曝光下成像。对照和实验动物都在非饱和条件下以固定曝光或通过将曝光设置为各自的对照进行成像。以前的报告表明，咽，神经元和肌肉外阴可通过双链RNA沉默抗性69，70，因此不包括在我们的得分。

所有被比较的图像都使用 Adobe Photoshop 进行了相同的调整以进行显示。

从 Tgfp 量化表达

将Tgfp插入基因组导致所有动物的 GFP 表达可变。然而，在交配诱导沉默的情况下，通过量化测量，沉默的动物没有显示出可检测到的 GFP 沉默。为了定量测量来自Tgfp的 GFP 荧光（补充图 1f），使用斐济（NIH）标记排除肠道的种系的 ROI，并测量强度。测量同一图像内蠕虫外部的区域的背景强度。如上所述，通过从测量的 GFP 强度中减去背景强度来计算来自Tgfp表达的平均荧光强度。

smFISH 信号的量化

在斐济 (NIH) 打开徕卡图像（.lif 格式），调整显示范围，使用 50 像素（~2.7 µm）的滚球半径依次减去背景两次，调整阈值，RNA 点数≤250物体体素的大小被量化为每单位面积。在比较的菌株图像中，所有参数都进行了相同的调整。所有被比较的图像都使用 Adobe Photoshop 进行了相同的调整以进行显示。

mCherry和gfp转录本的smFISH 信号（图 1b和补充图1b）之间的共定位是使用斐济内的共定位色图 插件完成的。插件查找从使用下式的两个图像之间的相同的空间坐标的像素强度之间的相关性：[（该像素的强度的mCherry RNA图像-在平均像素强度的mCherry RNA图像）×在（像素的强度GFP RNA图像− gfp RNA 图像中的平均像素强度)]/[( mCherry RNA 图像中的最大像素强度− mCherry 中的平均像素强度RNA图像）×（以最大像素强度GFP RNA图像-在平均像素强度GFP RNA图像）。相关值的范围在 1（最共定位）到 -1（最不共定位）之间，并由图中的比例表示。原始 mCherry 图像包含来自 mCherry::H2B（代表核染色质）和来自使用 Quasar 570 探针探测的mCherry RNA 的荧光信号。由于 mCherry 和 Quasar 570 的荧光光谱之间有很大的重叠，这些图像同时捕获了 mCherry 蛋白质和 RNA 信号。使用这些图像，我们获得了mCherry的近似值RNA 信号通过使用 DAPI 图像减去 mCherry::H2B 信号，其信号与 mCherry::H2B 信号一致，但与mCherry RNA 信号不一致。然后使用所得的减影图像（mCherry 蛋白 +  mCherry RNA - DAPI）来检查mCherryRNA 和gfp RNA之间的共定位程度（图 1b和补充图 1b）。

统计分析、再现性和绘图

对于每个图，使用χ 2检验来比较图例中所示的数据，除非在被比较的两个数据集中仅存在一个类别（明亮或静音）的情况下，在这种情况下使用威尔逊对比例的估计。显示的所有比较包括每个实验中仅 GFP 荧光或仅 mCherry 荧光之间的比较。使用学生t检验（图 2a（Tgfp），补充图1f、2c、6c、f、g） 比较 ChIP 和 qRT-PCR 实验和杂交的意义）。Matlab、R 和 Microsoft Excel 用于绘制荧光强度（条形图、玫瑰图、箱线图、点图、线图）和 qPCR 数据。源数据中提供了准确的P值。每个实验的生物学重复如图、图例和方法所示。实验进行一次或在源数据中指示的次数作为遗传杂交的独立交叉板。多个作者重复了关键实验（8 个作者的交配诱导沉默，2 个作者的pgl-1依赖性沉默）。在这些情况下，结果是可重现的。呈现的代表性图像来自不同的成像会话，其中观察到类似的模式和成像会话的数量，如下所示：图 2。 图1a显示了来自>10只动物的>10个会话的代表性图像；图 1c显示了每个类别 5-11 只动物的 1 个会话的代表性图像；图 2c来自 2 个会话和 92 只动物的马赛克表达（也用sur-5::gfp测试了马赛克，显示了类似的结果）；图 6a来自 1 个会话和 7 个动物的代表性 RNAi；图 1b和补充图 1b 代表 2 个会话和 6 个性腺的共定位图。

报告摘要

有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的 自然研究报告摘要。

数据可用性

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在这篇已发表的文章（及其补充信息文件）中。在这项研究中生成了 10,000 多张图像来记录表达水平。作者可应合理要求提供支持本研究结果的这些图像和其他数据。本文的源数据在