iPSC基因编辑细胞-为各类疾病研究打开新大门

iPSC基因编辑细胞-为各类疾病研究打开新大门

对于许多严重的疾病，例如心力衰竭、晚期糖尿病、血友病、骨髓瘤、末期肝硬化等，目前还未能研发出完全治愈这些疾病的药物，最有效的方法是异体移植。但是由于供体有限以及自体免疫排斥反应的风险，科学家们苦心专研，尝试寻找除异体移植外，更高效、安全的治疗方法。诱导型多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)可以来源于受体本身的体细胞，排除了免疫排斥反应的风险，且具有不断自我更新和多向分化潜能，iPS细胞来源的心肌细胞、肝细胞、神经细胞、T细胞、造血干细胞和胰岛细胞的移植治疗能够有效解决许多医学难题。通过CRISPR/Cas9的方法，将模拟疾病发生的突变引入iPSC，或修复iPSC疾病模型中的突变, 再分化得到所需要的细胞进行研究或治疗，是目前iPSC研究的大热门。

iPSC的CRISPR基因编辑，为各类疾病研究打开新大门

由于iPSC不像普通肿瘤细胞系那样具有总染色体异常和异常强烈的DNA损伤反应的特点，基因编辑在人类iPSC中成功率更低。但是由于CRISPR/Cas9具有效率高、易于构建和在人细胞中的毒性较低等优点，在iPSC基因编辑中备受青睐。

CRISPR/Cas9敲除iPSC中RAG2基因，有效生成具有稳定抗原特异性的CD8αβ-T细胞

T细胞的数量和增殖困难是T细胞免疫治疗的主要障碍，通过使用具有“再生”能力的多能干细胞诱导分化成为具有抗原特异性的T细胞（T-iPSCs）可以克服这一障碍。严格的抗原特异性对于安全有效的T细胞免疫治疗是必不可少的，然而，人T-iPSC分化的CD8αβ细胞在CD4/CD8双阳性分化过程中，通过T细胞受体（TCR）α链的重排会失去抗原特异性。通过使用CRISPR/Cas9敲除T-iPSCs中重组酶基因（RAG2）阻止了这种额外的TCR重排。含有稳定的TCR的CD8αβ-T细胞在异种移植肿瘤模型能有效地抑制肿瘤生长。这些方法有助于安全有效的T细胞免疫治疗。

CRISPR-U™可以通过核转染法高效地将gRNA和Cas9转入iPSC细胞中，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证，筛选出基因敲除的阳性克隆。（Minagawa, Atsutaka, et al.）

病人细胞构建iPSC疾病模型，使用CRISPR/Cas9修复引起疾病的点突变位点，深入研究点突变的病理性作用

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种进行性和不可逆转的神经退行性疾病，可导致神经细胞变性和脑萎缩，被认为是最常见的痴呆形式。PSEN1基因A79V突变可引起阿尔茨海默症，通过研究此突变对细胞表型的影响，可帮助研究者深入研究此疾病的病理，从而开发出更有效的治疗方法。研究者将阿尔茨海默症患者的体细胞诱导为多能干细胞（iPSC），然后通过用野生型序列替换点突变序列，修正突变的基因。通过研究患者的iPSC和修正后的iPSC，可以得知该突变对细胞表型的影响，从而深入研究该突变的病理性作用。

CRISPR-U™可以通过使用核转染法高效地将gRNA载体（含Cas9）和Donor共转入细胞中，gRNA和Cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，iPSC细胞以外源携带野生型序列的Donor作为模板进行同源重组修复（HDR），将目标序列重组到基因组点突变的靶位点上。（Pires, C., et al.）

iPSC的AAVS1安全位点敲入凝血因子9，所分化获得的肝细胞可用于治疗乙型血友病

目前治疗血友病最普遍的方法是替代疗法，但这种方法有病毒感染的风险，且是一种需要终生持续治疗的方法。只有基因治疗才能从根本上治愈血友病，CRISPR/Cas9系统可用于血友病的基因治疗。细胞中凝血因子8和9（F8和F9）突变是引起血友病的主要原因。之前就有研究表明F9是更有效的基因治疗目标。通过构建以AAVS1位点为靶点的AAVS1-Cas9-sgRNA质粒和AAVS1-EF1α-F9 cDNA嘌呤霉素donor 载体，并将其导入iPSC中。将F9 cDNA插入AAVS1位点的iPSCs分化为肝细胞，在培养上清中成功检测到人因子IX（hFIX）抗原和活性。最后，通过脾脏注射将肝细胞移植到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷病（NOD/SCID）小鼠体内，从而起到治疗乙型血友病的作用。

CRISPR-U™可以通过使用通过核转染法高效地将gRNA、Cas9和Donor共转入iPSC细胞中，进行药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出敲入纯合的阳性克隆。（Lyu, Cuicui, et al.）

 iPSC诱导分化，使“自体移植”不再遥不可及

人胚胎干细胞来源于早期胚胎而使其研究备受伦理争议，而且人胚胎干细胞来源的分化细胞进行异体移植时存在排斥反应，在一定程度上限制了其临床应用。iPSC可以诱导分化为不同种类的细胞用于科学研究。经过日积月累的研究开发，目前已经可以从患者组织（如成纤维细胞）或现有的iPSC中产生具有功能的、成熟的肝细胞、神经细胞、T细胞、心肌细胞、造血干细胞和胰岛细胞等。

iPSC诱导分化流程：