干货丨E0771细胞培养与基因编辑技巧指南

作为源自C57BL/6小鼠的经典乳腺癌模型，E0771细胞因其优异的免疫兼容性及对肿瘤免疫微环境的高度敏感性，已成为乳腺癌免疫治疗、免疫检查点抑制研究及基因编辑建模等热门领域的核心工具。从CAR-T疗法功能验证到CRISPR高通量筛选平台的构建，E0771细胞始终是科研工作者手中值得信赖的“利器”，助力深入探索肿瘤与免疫的前沿交汇。本文将全面梳理E0771细胞的使用要点，分享一线科研人员总结的培养经验与高效基因编辑技巧，助你高效推进实验进程，轻松拿下科研关键环节。

细胞信息

细胞名称：E0771（小鼠髓样乳腺癌细胞）

细胞形态：呈上皮样，贴壁细胞

细胞培养条件：90%DMEM+10%FBS

气相：空气，95%；二氧化碳，5%

温度：37℃

换液频次：2-3天/次细胞

传代比例：1:2-1:4

细胞生长正常图片：以贴壁形式生长，单层铺展，通常呈多角形或梭形，细胞边界清晰。

细胞生长状态差图片：细胞形态会发生改变，细胞变圆、漂浮增多；细胞出现空泡；细胞坍塌不立体，细胞出现老化。

细胞复苏

1)准备：取7mL完全培养基于离心管中备用

2)解冻：将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴

3)离心：将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液

4)重悬与接种：用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中

5)培养：将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况

细胞传代（以T25瓶为例）

1)当细胞汇合度达到80-90%时可进行传代，传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次

2)加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育 1-3分钟，待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化

3)加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化，然后转移至15mL离心管中

4)1100 rpm 室温离心 4 分钟，离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞

5)细胞按照1:2-1:4比例传代，传代第二天观察细胞状态

细胞冻存

1)收集细胞：按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中

2)离心：1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清

3)重悬与冻存：用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息

4)降温与储存：将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存

注意： 细胞速度较快，需合理控制传代比例； 细胞换液时请先预热培养基，防止细胞收缩；若细胞出现收缩现象，建议消化后进行1：1传代即可

细胞状态差如何调整

1.培养基和血清：确保使用正确的基础培养基，尽可能使用优质胎牛血清或根据细胞状态适当调整血清比例

2.细胞培养环境：确认培养温度、湿度、气象条件是否正常

3.避免使用过期或长时间存放的培养基，新鲜配制的完全培养基建议在两周内使用完毕

4.细胞传代操作：细胞传代时，注意消化时间和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤

5.消化过度或培养基pH值异常：缩短消化时间和调整培养基地pH

6.细胞聚集成团：消化后轻柔吹打（使用枪头反复吹吸至单细胞悬液）；可尝试用Accutase替代胰酶（温和解离细胞）

细胞老化如何调整

1.确认培养条件以及培养环境是否正确

2.避免胰酶消化过度：合适的胰酶浓度和消化时间，避免用力吹打，造成细胞损伤

3.增加血清浓度/选择高质量胎牛血清

4.调整细胞密度：细胞密度过高会导致营养不足和代谢废物积累，从而加速细胞老化，应将细胞密度控制在适宜范围内

5.添加生长因子，可以促进细胞增殖和分化，有助于改善细胞老化状态

6.换低代次细胞

7.通过挑选单克隆等方法，从老化的细胞群体中筛选出具有生长优势的单克隆细胞，进行纯化培养

E0771细胞转染时注意事项

1.确保细胞状态良好，细胞处于对数生长期，此时细胞活性高，分裂旺盛，有利于转染效率的提升，细胞密度一般在70-80%之间

2.注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害

3.实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团

4.细胞进行实验时活率≥80%

5.电转法进行实验时控制好电转细胞量，电转后接种到合适的培养板里

6.用电转法进行实验时要保证电转后细胞贴壁率≥70%

8.用电转法转染后细胞状态可能会变差，此时可提高血清浓度对细胞进行培养

9.慢病毒法进行实验时要控制好感染前的细胞汇合度30-40%之间，不可过高

10.选用病毒法进行正式实验前可进行预实验找到最合适的MOI;感染前添加助染剂 Polybrene

11.对于转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性

12.建议进行药筛预实验找到最佳药筛浓度，以便于转染后进行药筛

E0771铺单克隆实验注意事项

1.确保铺克隆实验前细胞状态正常，老化细胞少，建议控制细胞汇合度在70%左右

2.铺克隆时细胞活率≥85%

3.可先进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低

4.细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀

5.稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间

慢病毒感染图:

电转法转染图片：