Caco-2细胞培养与基因编辑：这些技巧让你事半功倍！

Caco-2细胞是一种人结肠腺癌细胞系，因其在体外培养时能分化为具有刷状缘和紧密连接的上皮细胞，模拟了人体小肠上皮细胞的许多功能，成为研究肠道吸收、药物转运和毒理学评估的重要模型。随着基因编辑技术的发展，CRISPR/Cas9基因修饰的Caco-2细胞更是推动相关领域特定基因的功能和调控机制的研究。今天，小源和大家分享一些Caco-2细胞的培养和基因编辑的小技巧。

内容

01 Caco-2细胞基本信息

02 Caco-2细胞培养

03 Caco-2细胞培养Tips

04 Caco-2基因编辑Tips

Caco-2细胞基本信息

 细胞名称 Caco-2（人结直肠腺癌细胞）

细胞形态 上皮样，贴壁细胞，有部分含有液泡的巨大细胞

细胞培养条件

培养基：77%MEM＋20%FBS+1%Glutamax+1%SodiumPyruvate+1%NEAA

气相：空气，95%；二氧化碳，5%

温度：37℃

换液频次 2-3天/次

传代比例 1:2-1:4

图1 Caco-2细胞生长正常

细胞与细胞间紧密连接，一般呈岛状生长，细胞群的边界光滑，细胞群中常常含有巨大的空泡，这是细胞本身的特性，属于正常现象。

图2 Caco-2细胞生长状态差

细胞形态异常，如细胞老化，细胞可能变得不规则，失去典型的铺路石样外观等。

Caco-2细胞培养细胞复苏

1) 准备：取7mL完全培养基于离心管中备用

2) 解冻：将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴

3) 离心：将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液

4) 重悬与接种：用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿/瓶中

5) 培养：将培养皿/瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况

细胞传代（以T25瓶为例）

1) 当细胞汇合度达到80%时可进行传代，传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次

2) 加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育 5-10分钟，待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化

3) 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化，然后转移至15mL离心管中

4) 1100 rpm 室温离心 4 分钟，离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞

5) 细胞按照1:2-1:4比例传代，传代第二天观察细胞状态

细胞冻存

1) 收集细胞：按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中

2) 离心：1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清

3) 重悬与冻存：用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息

4) 降温与储存：将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存

Caco-2细胞培养Tips

1. Caco-2细胞复苏或者传代后贴壁比较慢，大量细胞会漂浮并存在一些碎片，最终会以岛状形态贴壁并扩散生长，建议48小时内不要进行换液。

2. 细胞易聚集，消化后要充分吹打但不要剧烈，防止损伤细胞。

3. 细胞形态不均一，有一些含有液泡的巨大细胞，且细胞胞体内有黑色颗粒物，分泌少量黑色颗粒属于正常现象。

4.消化时要控制好时间，尽量把细胞消化为单个细胞，一般消化时间为5-10分钟。

5. 接种密度不宜过低，建议每次传代比例为1:2-1:4，建议细胞接种后培养箱培养48h再拿出进行观察，更有利于细胞贴壁。在细胞密度达到80%左右时进行传代，以维持细胞的健康状态。

6. 培养该细胞建议使用优质胎牛血清。

细胞状态差如何调整：

1. 培养基和血清：确保使用正确的基础培养基和优质胎牛血清，血清比例对Caco-2细胞的贴壁性有重要影响。当血清比例低于20%时，细胞的贴壁时间延长，甚至可能不贴壁。因此，建议确保血清比例不低于20%。

2. 换液频率：由于Caco-2细胞的生长和贴壁较慢，建议每2~3天换一次液，以保持培养环境的稳定。

3. 细胞培养环境：确认培养温度、湿度、气相条件是否正常。

4. 避免使用过期或长时间存放的培养基，新鲜配制的完全培养基建议在两周内使用完毕。

5. 细胞传代操作：细胞传代时，注意消化时间和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤。

细胞老化如何调整：

1. 确认培养条件以及培养环境是否正确。

2. 避免胰酶消化过度：合适的胰酶浓度和消化时间，避免用力吹打，造成细胞损伤。

3. 增加血清浓度/选择高质量胎牛血清。 

4. 调整细胞密度：细胞密度过高会导致营养不足和代谢废物积累，从而加速细胞老化，应将细胞密度控制在适宜范围内。

5. 添加生长因子，可以促进细胞增殖和分化，有助于改善细胞老化状态。

6. 换低代次细胞。

7. 通过挑选单克隆等方法，从老化的细胞群体中筛选出具有生长优势的单克隆细胞，进行纯化培养。

Caco-2基因编辑TipsCaco-2细胞转染时注意事项：

1. 确保细胞状态良好，细胞处于对数生长期，此时细胞活性高，分裂旺盛，有利于转染效率的提升，细胞密度一般在70-80%之间。

2. 注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害。

3. 实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团。

4. 细胞进行实验时活率≥80%。

5. 电转法进行实验时控制好电转细胞量，电转后接种到合适的培养板里。

6. 用电转法进行实验时要保证电转后细胞贴壁率≥70%。

7. 用电转法进行转染时需控制好实验时间，电转全程不宜过长。

图3 电转Caco-2细胞

8.慢病毒法进行实验时要控制好感染前的细胞汇合度30-40%之间，不可过高。

9.选用病毒法进行正式实验前可进行预实验找到最合适的MOI;感染前添加助染剂Polybrene。

10.对于转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性。

图4 慢病毒感染Caco-2细胞

Caco-2铺单克隆实验注意事项：

1. 确保铺克隆实验前细胞状态正常，老化细胞少，建议控制细胞汇合度在70%左右。

2. 铺克隆时细胞活率≥85%。

3. 可先进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低。

4. 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀。

5. 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间。