青海省民和县喇家遗址出土汉代马骨的DNA 初步研究

　　摘要：运用古DNA技术对青海省民和县喇家遗址汉代灰坑中出土的8匹马的骨骼进行了遗传学分析，通过提取DNA并对线粒体DNA和毛色控制基因的核DNA进行PCR扩增和测序，全部样本都获得了线粒体12SrRNA基因的部分DNA片段，序列分析结果表明喇家遗址这8例汉代马骨均属于家马的范畴。其中6个个体还获得了线粒体DNA控制区序列，在这6个序列中共检测出5个不同的单倍型，归属3个不同的谱系A、D和F。毛色控制基因的SNP检测结果显示该遗址汉代家马的毛色有枣色（bay）、栗色（chestnut）和黑色（black），都是常见的属于纯色的马匹毛色。本文的家马毛色研究发现中国古代家马毛色多样性是从西向东逐渐递减的，从另一个侧面反映出经新疆、甘青入中原地区是古代家马进入中国的一条主要路线。作为丝绸之路的一部分，喇家所在的甘青地区有着独特的地理位置，位于中原地区和新疆地区之间，是家马从新疆到中原的经由之路。本文的马骨DNA研究为进一步深化甘青地区的考古学研究提供了新的材料。

喇家遗址位于青海省民和县官亭镇喇家村，地处黄河上游的官亭盆地，坐落在黄河河谷地带北岸的二级阶地上。地理坐标为北纬35°42′～37°09′，东经101°05′～103°01′，是我国首次发掘的大型史前灾难遗址。该遗址一系列重要考古发现引起了国内外学者的广泛关注，例如喇家遗址发现了目前世界上最早的“面条”；房址内发现数量不等人骨，姿态各异，一组组呈不同姿态分布于居住面上，有的相拥而死、有的倒地而亡、有的匍匐在地、有的母子相依等。2015年7月至12月，青海省文物考古研究所联合四川大学考古系、喇家遗址博物馆对喇家国家考古遗址公园即将施工区域进行了发掘，又发现了齐家文化、辛店文化和汉晋时期遗存，以齐家文化遗存为主。汉晋时期遗迹包括灰坑55个，灰沟2条。汉代遗物有陶器、铁器、骨器、玉石器、铜钱等。汉代遗迹填土多为灰黑土，其内夹杂大量动物骨骼，也浮选出较多植物种子。

作为丝绸之路的一部分，喇家地区也应该是一个重要的“东西交流”的通道。喇家遗址距离著名的“临津古渡”只有7公里。“临津古渡”始于汉代，繁荣于唐宋时期，从汉到明、清以及近代一直是黄河上游的重要渡口，可以西进新疆、南入西藏。“临津古渡”所在的甘青地区是沟通中原和新疆的通道，文化上是联系中西文化的桥梁，在历史上发挥着重要的作用。

中国现在所见的家马应该是在青铜时代最早从境外交流进来的。考古学证据表明，家马遗骸最早发现于乌克兰的Dereivka和哈萨克斯坦的Botai遗址，中亚地区是家马起源、驯化、并向外扩散的中心地区。甘青地区应该是这种交流的经由之地，而且这种交流可能是持续的，比如有文献记载称，通过丝绸之路，汉武帝派人到中亚找寻“天马”或“汗血宝马”。作为黄河上游少数几个主要的古渡口之一，“临津古渡”及周边地区在历史上也可能是“东西交流”的重要集散地之一。喇家遗址出土的汉代马骨遗存为我们研究“临津古渡”开始使用时期可能用于集散的古代家马的特点提供了材料。

本文以青海省民和县喇家遗址出土汉代马骨为研究对象，用古DNA的研究方法，揭示该地区汉代家马的遗传结构特点，并与甘青周边地区以及中国其他地区古代家马进行比较。本文研究也期望为今后甘青地区大样本的古代家马DNA研究提供新的数据。

一、材料与方法

1、样本采集

在动物考古学家进行种属鉴定等形态学研究的基础上，本文对喇家遗址2015年发掘出土的8例马骨样本进行了采集，采集部位均为骨质保存较好的肢骨。这8例马骨全部是出于灰坑中的破碎骨骼，而不是完整的马骨架，的年代均为汉代，样本的具体信息见表一。

2、样本处理与DNA提取

首先取马骨上约1cm×1cm见方的小块，用钻头打磨骨骼表面和截面以去除骨骼表面尘垢，次氯酸钠溶液（有效氯6％）浸泡和紫外照射（紫外灯置于样本以上8cm的高度，波长254nm，），用以去除骨骼表面的外源DNA污染。之后使用冷冻研磨机打磨成粉。在此基础上采用Yang等提出的硅柱离心法进行DNA提取。

3、DNA扩增与测序

首先，选择引物L1269/H1346扩增线粒体基因组中12SrRNA基因，对所选样本进行初步种属鉴定。在此基础上，本文选择了蔡大伟等设计的两对套叠引物来扩增古代家马的线粒体DNA控制区的DNA片段（15473~15772，包括引物长度），优化选择使用Ludwig等已发表的引物来扩增毛色控制基因的核DNA片段。全部扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR阳性产物送到测序公司（Invitrogen）直接测序，正反引物双向测序。在全部实验过程中，严格按照防污染措施操作，具体实验操作详见。

4、数据分析

PCR产物所得到的序列使用Chromas Pro软件进行读取，通过ClustalX2软件进行序列比对，并使用BioEdit进行编辑。使用Network5.0软件构建中介网络图，选择中国考古遗址出土家马（见表四）作为对比序列，详见图一。

二、结果

1、线粒体DNA序列变异情况及单倍型类群归属

全部8个古代样本都获得了线粒体基因组中12SrRNA基因的部分DNA序列（引物L1269/H1346，去除两端引物后序列长度为77bp），在GenBank数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）对这些DNA序列进行了BLAST共享序列搜索，结果发现这些共享序列全部属于家马。

其中，有6个古代马骨样本都获得了线粒体DNA控制区的262bp序列（15493~15754，去除两端引物）。以X79547作为参考序列进行比对，实验结果见表二。共检测出14个多态性变异位点，全部为转换，没有颠换、插入与缺失，且转换主要在嘌呤之间，占57.1%（8/14）。另外2个古代马骨样本（EQC224与EQC226）虽然也获得了线粒体DNA控制区的序列，但是多次DNA提取得到的序列结果不能完全匹配，因此本文将这2个样本的实验结果确定为失败。所获得的6个序列中共检测出5个单倍型，其中EQC229与EQC230共享同一单倍型。根据Jansen等、McGahern等的关于单倍型类群的划分，基于线粒体DNA序列变异模式，本文的5个单倍型可以归属于单倍型类群A6、D2、D3和F3，详见表二。

2、毛色控制基因的SNP位点检测

依据以前研究，本文亦选择常见的和研究相对较深入的6种毛色控制基因的8个SNP位点进行检测，包括MC1R(g.201)、ASIP(g.2183~2193del)、MATP(g.72)、KIT(g.786)、KIT(g.1120)、SILV(g.1457)、SILV(g.697)、EDNRB(c.323_333)，其野生型为E/E、A/A、C/C、KM0/KM0、sb1/sb1、z/z、z/z、ov/ov。

本文选择的8个古代马骨样本中，有6个样本获得了全部SNP变异结果，另外2个样本（EQC224与EQC226）获得了部分SNP变异结果，由于这2个样本所得SNP位点结果太少无法对毛色进行推测，因此下文中不再对其进行讨论。毛色控制基因的SNP位点检测结果详见表三。在本文检测的6个样本中，有1个样本（EQC227）的基因型与野生型相同，其余5个样本的基因型与野生型不同，但是发生变异的只有MC1R(g.201)和ASIP(g.2183~2193del)两个基因位点，控制的表型分别为栗色（chestnut）和黑色（black），其他基因位点MATP(g.72)、KIT(g.786)、KIT(g.1120)、SILV(g.1457)、SILV(g.697)和EDNRB(c.323_333)未发生变异。

结合已有的关于家马毛色基因的研究，根据本文毛色基因SNP位点的检测结果及其所控制的表型特征，对喇家遗址出土的这6匹古代马的毛色进行推测：EQC227、EQC229和EQC230应该是枣色（bay），EQC225和EQC231应该是栗色（chestnut），EQC228应该是黑色（black）。

三、讨论

1、线粒体DNA研究

为了便于和以往已经发表的中国古代家马线粒体DNA单倍型类群进行对比分析，本文仍然依据Jansen等与McGahern等的命名原则和划分方法。以此，本文从6个个体中检测到5个线粒体DNA单倍型，分别可以归属于谱系A、D和F，进一步细分分别归属于单倍型类群A6、D2、D3和F3。在现代家马群体谱系中，B、C、E和G的分布频率普遍较低，但A、D和F的分布频率较高。显然喇家汉代家马的线粒体DNA单倍型归属于现代家马常见的谱系，而且这6个个体的线粒体DNA单倍型中没有检测到属于普氏野马的单倍型类群A2。全部8个个体的线粒体12SrRNA基因的部分DNA序列结果表明，喇家遗址这8例汉代马骨均属于家马的范畴。

将已有研究成果与本文结果进行统计与比较（见表四和图一）。目前中国古代家马的线粒体DNA控制区序列已经达到65个（九龙山JLS02H只有部分序列不能进行单倍型类群划分，在此未加入统计分析），可以归属于谱系A（A1、A3、A4、A6、A7）、B（B2）、C（C1、C2）、D（D2、D3）、E、F（F1、F2、F3）和G，表现出非常高的线粒体DNA遗传多样性。

本文研究的喇家汉代家马所有的线粒体DNA单倍型都能在其他中国古代家马中找到与之完全相同或仅相差一个位点的共享序列。例如，属于单倍型类群F3的EQC225，与平顶山EQC88（频率1/8；年代青铜时代中晚期）具有相同的线粒体DNA控制区序列；属于单倍型类群A6的EQC228，与丰台Fen2（GenBankNO.:FJ204378，频率1/2；年代1000~800BC）具有相同的线粒体DNA控制区序列。属于单倍型类群D2的EQC227，与板城LB04（GenBankNO.:EU931599，频率1/7；年代2500aB.P.）相差一个位点为15585，与平顶山EQC90（频率1/8；年代青铜时代中晚期）相差一个位点为15602；属于谱系F3的EQC231，与于家庄YJZ02（GenBankNO.:EU931608，频率1/2；年代2500aB.P.）相差一个位点为15597，与井沟子LJM52（GenBankNO.:DQ900930，频率1/4；年代2115±65aB.P.）相差一个位点为15595。

根据已经发表的中国古代家马DNA研究成果，本文依据遗址所处地理位置，为了便于地区之间的比较，将这些遗址划分为四个区，新疆地区（包括平顶山和石人子沟）、甘青地区（包括喇家、于家庄、丰台、九龙山和中庄）、内蒙古长城地带（包括大山前、井沟子、板城、小双古城和新店子）和中原地区（包括毛园和枣树沟脑）。虽然这些遗址所处的时间范围非常大（从距今4000年至汉代），但是都不晚于喇家汉代家马的年代，因此有着很好的可比性；虽然这些遗址分布的地域范围非常广，从东北到西北，但是喇家和这些地区的家马之间应该有着某种“渊源”关系。

作为甘青地区的一部分，可以很好地理解喇家家马和甘青地区的家马关系更近一些。由于甘青地区和新疆地区及内蒙古长城地带之间有着长期经常性的文化和群体交流，同样可以理解喇家家马和这些地区的家马也有着比较接近的关系。中原地区的家马是常年不断的从甘青地区引进的，应该和这些地区的家马是密切关联的。但是如果中原地区是引进的终点，没有反向的交流，长此以往，中原地区家马就会演变出一些独特的群体遗传特点。此外除了从甘青地区引进家马，也许还存在其他的途径将家马引入到中原地区。因此相比较而言，喇家汉代家马和中原地区家马的群体遗传结构也许会有更多的差异。当然，本文研究的样本量太小，这些观察需要进一步的研究得以证实。

2、毛色研究

有研究认为，在家畜驯化过程中，对动物本身而言有一个人为选择取代自然选择的过程。在家马引进选择的过程中，一些形态和行为特征可能会成为人为选择的标准，例如毛色。Ludwig等对欧亚大陆发现的古代马的毛色进行了SNP检测，发现距今5000年以来，在西伯利亚与东欧地区家马毛色的多样性迅速且持续地增加。因此推测毛色多样性的出现，很可能反映当时人们有计划地选择、改进或引进新品种。

喇家遗址的汉代灰坑中出土的家马骨骼，可以确定的毛色有枣色（bay）、栗色（chestnut）和黑色（black），都是常见的属于纯色的马匹毛色，未发现有带白斑的基因突变。目前关于中国古代家马毛色的研究还比较少，目前已发表的有4个遗址：青海丰台遗址的4匹家马有3匹枣色（bay）、1匹枣色带有白斑（bayTobiano）；陕西枣树沟脑遗址马坑出土的4匹家马有3匹枣色（bay），另一匹的主要毛色可能为枣色（bay）或黑色（black）不能确定是否存在斑点状纹饰；新疆石人子沟遗址的5匹家马有3匹栗色（chestnut），其余2匹分别为枣色（bay）和金黄色（palomino）；新疆平顶山墓群的8匹马有3匹栗色（chestnut）、2匹栗色有白斑（chestnut tobiano）、2匹黑色（black）、1匹金黄色（palomino）。

与同属于甘青地区的丰台遗址相比，年代较晚的喇家遗址的家马毛色相对多样，推测随着时间的发展，有可能引进了新的马匹品种，也有可能引进了新的育种技术。如果仍然将这几个遗址按地域进行划分来看不同地区古代马的毛色多样性变化，新疆地区马的毛色最丰富，甘青地区次之，中原地区最少。中原地区仅有枣树沟脑一个遗址共4匹马的材料，与其他地区相比样本量非常少，可能存在样本数量的偏差。但是从总的趋势可以看出来，古代家马毛色多样性是从西向东逐渐递减的。一般认为，生物扩散或迁徙的结果是原地区群体的遗址多样性要比新进入地区的高，这是因为在扩散或迁徙过程中，总有一些个体或亚群体保留在原地未迁出。因此本文研究结果从侧面反映出经新疆、甘青入中原地区是中国古代家马进入中国的一条主要路线。

喇家遗址所在的甘青地区位于中原地区和新疆地区之间，这一区域相对独立，呈走廊状，地理上是沟通中原和新疆的通道，文化上是联系中西文化的桥梁，在历史上发挥了重要的作用。甘青地区处于干旱、半干旱地带，对生产力有限的史前人类而言，经济方式很大程度上受气候的影响。当气候适宜的时候可以发展农业，当气候条件恶劣的时候农业生产会受到很大影响。有学者认为距今4000年前后由于受气候变化的影响，甘青地区的生业模式开始由农业或半农半牧向以牧业为主转变，驯化家马的引入加速了甘青地区史前人类生产经营模式的转变。

西汉武帝派张骞出使西域，即以长安（今西安）为起点，经甘肃、新疆，到中亚、西亚，联结地中海各国的陆上通道，经此丝绸之路，驯化的家马会源源不断东进到达中原地区。黄河上游的重要渡口“临津古渡”，可能就是丝绸之路过黄河的几个重要通道之一。如果古代文献记载可靠，引进的“天马”或“汗血宝马”很有可能是经由此地进入当时的中国内地的。

“汗血宝马”在中国历史文献上有提及，但现代生物学上估计很难科学地对此马进行定义，因此目前也尚无现代DNA标记来识别“汗血宝马”。古DNA研究尤其是古代线粒体DNA对该问题目前是“无能为力”的。今后如果现代遗传学研究能够识别并标记出现代的“汗血宝马”，那么运用大规模测序技术（Next Generation Sequencing），对汉代家马进行大样本量的古DNA基因组研究，则有可能证明历史上汉武帝派人到中亚寻回“天马”或“汗血宝马”的故事。若如此，本文喇家汉代家马以及其他古渡地区的汉代家马DNA样本就可能是研究“汗血宝马”的首批材料。

四、结论

通过对青海喇家汉代灰坑中出土的马骨进行线粒体DNA和毛色控制基因的核DNA分析，本文得出以下认识：

DNA分析揭示喇家出土的汉代家马的线粒体DNA群体遗传特点显示出其为常见的线粒体单倍型类群，和甘青地区其他遗址的家马表现出非常近的亲缘关系，与新疆地区和内蒙古长城地带（包括中原地区）的古代家马没有很大的差异，反映出喇家所在的甘青地区在沟通中原地区和新疆地区中所处的独特地理位置，甘青地区也因此成为家马从新疆到中原的经由之路。

毛色控制基因的核DNA研究显示喇家遗址出土家马的毛色有枣色（bay）、栗色（chestnut）和黑色（black），都是常见的属于纯色的马匹毛色。通过与其他遗址出土家马毛色进行比较发现，中国古代家马毛色多样性是从西向东逐渐递减的，从侧面反映出经新疆、甘青入中原地区是中国古代家马进入中国的一条主要路线。

致谢：感谢青海省文物考古研究所、四川大学考古系、喇家遗址博物馆为本研究提供了宝贵的样本。