脂代谢基因调控癌细胞转移？CRISPR文库精准锁定关键靶点

研究背景

癌细胞转移是导致癌症死亡率高的主要原因。为了转移并定植到远端器官，癌细胞可能需要进化出特定的脂质代谢程序，以支持其转移和增殖能力，但是关于癌细胞脂质代谢的调控机制还不清楚。

今天，小源给大家解读一篇发表在顶刊Cell上题为“ACSL4 and polyunsaturated lipids support metastatic extravasation and colonization”的研究论文，该研究结合组学分析以及CRISPR文库筛选方法，揭示了癌细胞转移与多不饱和脂肪酸之间的关联。

CRISPR文库筛选

文库：人代谢基因敲除文库

筛选方式：体内筛选

筛选策略：

1. 两种不同的高转移潜能癌细胞进行体内筛选。2. 经人代谢基因敲除文库一轮筛选后，选取潜在靶基因二次深度筛选。3. 收集癌细胞转移后肿瘤组织，寻找癌细胞转移相关靶点。实验结果1. 癌细胞转移潜能与铁死亡敏感性联合分析

使用MetMap（Cancer Metastasis Map）和CTRP（Cancer Therapeutics Response Portal）数据集联合分析，研究发现具有高转移潜能的癌症类型（如卵巢癌、肝癌和头颈癌）对铁死亡更加敏感。

基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的脂质组学研究发现，与患者的原发性肿瘤细胞相比，转移灶肿瘤细胞表现出更高的多不饱和脂肪酸（PUFA）脂质水平。铁死亡的关键特征之一就是脂质过氧化，而PUFA是脂质过氧化的主要底物。这些结果表明，具有较强转移潜力的卵巢癌细胞可能是由于具有较高水平的PUFA，从而对铁死亡敏感。

图1 联合分析发现铁死亡与癌细胞转移潜能相关

2. CRISPR文库筛选揭示促癌细胞转移基因

代谢适应对于癌症转移是非常重要的，为了寻找促癌症转移相关基因，研究者们使用人代谢基因敲除文库构建了卵巢癌ES-2文库细胞，并进行体内筛选。将ES-2文库细胞皮下注射后，通过对比转移至肝和肺的肿瘤细胞和原位皮下肿瘤细胞之间的差异，发现在肝转移肿瘤和肺转移肿瘤中，一些与膜脂代谢和脂肪酸氧化相关的基因，如TM7SF2、PHYH、PIK3CG和PLA2G4C均被显著富集。

为了进一步验证初筛结果，研究者们使用第一次筛选出的前100个被显著富集或丢失的基因进行了二轮筛选。通过比较分析发现，NMNAT1和HADHB基因在肝和肺转移肿瘤中均显著丢失。此外，不饱和脂肪酸代谢相关基因ACSL4在肺转移肿瘤中也被显著丢失；通过相关性分析也发现ACSL4基因表达量高的卵巢癌细胞也具有更高的转移潜能。

图2 CRISPR文库筛选揭示癌细胞转移调控基因

3. ACSL4促进癌细胞在血液转移过程中外渗

为了确认ACSL4基因在癌细胞转移过程中的作用，研究者通过尾静脉注射ACSL4基因敲除ES-2细胞后，结合免疫荧光，发现静脉注射的ACSL4基因敲除ES-2细胞形成的转移病灶更少、更小，而且这些病灶显示出不寻常的血管内定位，频率很高，表明外渗功能受损。ACSL4作为不饱和脂肪酸合成过程中的关键酶，研究者们推测ACSL4基因敲除后细胞膜流动性可能受损。通过荧光探针以及Transwell检测，研究发现ACSL4基因敲除会显著降低细胞膜流动性，并影响细胞侵袭能力，而通过ARA预处理以提高细胞的PUFA含量，可以提高ACSL4基因敲除ES-2细胞尾静脉注射的肿瘤转移能力。这些结果表明，ACSL4通过调控细胞膜PUFA含量，增强扩散癌细胞的膜流动性和侵袭性来促进转移性外渗。

图3 ACSL4促进癌细胞转移外渗

4. ACSL4还会促进其他癌症细胞转移

研究者进一步使用具有高转移潜能的肝癌细胞SK-HEP-1进行了CRISPR文库筛选，同样发现NMNAT1和ACSL4基因被显著丢失。并且通过ACSL4基因敲除和ARA处理增加细胞PUFA含量，证实了不饱和脂肪酸对癌细胞转移的促进作用。

图4 ACSL4在肝癌细胞CRISPR文库筛选中被显著富集

5. ACSL4和ECH1双重抑制可抑制癌症转移

尽管ACSL4敲除能抑制癌细胞的转移，但是由于肿瘤具有高度侵袭性，后期肿瘤转移负荷仍然难以控制。为了探索抑制肿瘤生长/转移的方法，研究者们通过比较植入后肿瘤中sgRNA丰度和注射前细胞中sgRNA丰度，发现ECI1、ECH1等基因在各种转移瘤中均显著丢失，敲除这些基因也显著抑制了癌细胞的生长。进一步，通过构建ACSL4和ECH1双基因敲除细胞系，研究发现与单基因敲除细胞相比，双基因敲除细胞肺转移负荷明显减少。

图5 ACSL4和ECH1双基因敲除抑制癌细胞转移

结论

通过CRISPR筛选，研究者鉴定出ACSL4是促进血行转移的关键因子，其通过增强细胞膜流动性和侵袭性来促进转移。此外，高PUFA含量的肿瘤细胞依赖ECI1/ECH1进行β-氧化，联合抑制ACSL4和ECH1可有效抑制癌症转移。