【疫苗简史】新冠疫苗为啥没有减毒活疫苗问世？开发一款减毒活疫苗到底有多难

作者 | 王新宇

转载自公众号“华山感染”

今天我们就要和大家介绍一款减毒活疫苗—黄热病17D疫苗开发的故事，聊一聊开发一款成功的减毒活疫苗到底有多难。

第一步 认识疾病

黄热病是一种高度致命的病毒性传染病，导致肝、肾和心肌损伤，出血和休克。目前仅在南美和非洲的热带地区发生流行。该病的传播媒介是一种叫做埃及伊蚊的蚊虫。黄热病不但可以感染人类，也可以在非人类灵长类动物中传播。因此黄热病不能像天花一样做到根除，唯一可靠预防该疾病的方法是对易感的人群进行疫苗接种。

在历史上，黄热病曾经在整个美洲和西非地区肆虐。历史上影响最大的一次疫情发生于1793年，在当时美国羽翼未丰的联邦首都费城，那里占总人口10％的人因为感染黄热病而丧生。当时，黄热病被广泛认为是由污物，污水和腐烂的有机物引起的一种空气传播的“ 瘴气”。

小说《热病1793》记录了1793年费城暴发黄热病的恐怖场景

在没有找到致病因素的情况下，疫苗接种是一个遥不可及的目标。一直到1878年，在密西西比河下游地区的一次暴发仍然有20,000人死亡。如果你是福尔摩斯探案集的忠实粉的话，一定记得有一篇叫做“黄面人”的短篇小说，里面女主人公的前夫就是死于美洲暴发的黄热病。

福尔摩斯探案集-黄面人中女主角的前夫死于黄热病

十九世纪下半叶，包括卡洛斯·芬莱在内的几位医生提出，黄热病是通过蚊子传播的。当时疾病的细菌理论和科赫关于微生物因果关系的假设已经被欧洲主流科学所接受，芬莱在此基础上提出蚊子携带黄热病的“病菌”。

古巴流行病学家卡洛斯·芬莱发现黄热病是通过蚊子从感染的人传播到健康的人的

1900年，时值美西战争期间，黄热病在古巴岛上流行，对占领的美军构成了严重威胁。由美军少校沃尔特·里德（Walter Reed）领导的黄热病委员会证明该病原是一种可过滤的病毒，并且可通过直接注射血液或由埃及伊蚊传播。

沃尔特·里德（1851-1902）

他们发现如果是通过蚊子传播，蚊子叮咬患者以后，要经过12天的体外潜伏期才具有传染性，也就是病毒在蚊子体内还有一个复制的过程。他们还发现人类如果被具有传染性的蚊子叮咬后，到发病中间也需要间隔3-6天的潜伏期。

第二步 找到病原体

虽然之后，很多人也证实了里德的发现，但从病因学上的“病毒”却没有得到分离和鉴定。

美国陆军外科医生沃尔特·里德少校及其对黄热病起因的发现是医学和人类历史领域最重要的贡献之一

一直到1927年，广泛的黄热病席卷了非洲沿海地区，由洛克菲勒基金会建立的西非黄热病委员会成员亚历山大·马哈菲，在加纳将一名名叫阿西比（Asibi）的28岁的病人血液接种到恒河猴体内。四天后，猴子垂死并显示出与黄热病相一致的肝损伤。将该猴子的血液再次接种第二只动物后，又一次引起了临床黄热病。

首先从这位叫Asibi的加纳患者体内分离到了黄热病毒

于是黄热病的病原终于被找到了。

第三步 让病毒在实验室活下去

黄热病委员会的研究人员通过在猴体内连续直接传代和通过埃及伊蚊间接传代建立了Asibi病毒株，而Asibi将会是此后17D疫苗的母本病毒株。除了确定黄热病的致病因子并确认它是可过滤的病毒因子外，研究人员还证实恒河猴是易感宿主，这为测试未来的候选疫苗提供了宝贵的研究工具。

洛克菲勒西非黄热病研究委员会在西非实地

就在差不多时候，法国巴斯德研究所位于达喀尔的分支，从一名叙利亚患者中分离了黄热病病毒，起名为“法国病毒株”。

分离到Asibi病毒株和法国病毒株是开发疫苗的关键。

第四步 试试灭活疫苗行不行

使用新分离的病毒进行主动免疫的最早尝试是1928年在伦敦惠康研究实验室的爱德华·欣德尔，他使用从感染了法国病毒株的猴子肝脏和脾脏组织制备的疫苗，并用福尔马林或甘油-酚灭活。皮下注射灭活疫苗的恒河猴在一周后再接种大剂量病毒后仍存活下来，而未接种疫苗的动物死亡。

但是当时缺乏有效的病毒繁殖、效价测量和灭活过程控制方法，从而阻碍了灭活疫苗的制备。一些制剂可能包含激发免疫的残留活病毒，而另一些则在灭活过程中降解且缺乏效力。 

1929年，洛克菲勒研究所国际卫生部实验室的后来主任威尔伯·索耶和纽约洛克菲勒基金会的同事生产了由感染黄热病的恒河猴血清经过化学处理制造的疫苗。这些制剂的的抗原活性和安全性都不一致，导致研究人员得出结论，化学处理剧毒病毒不太可能产生安全可靠的疫苗。

黄热病灭活疫苗的尝试就此宣告失败。

第五步 建立小动物模型

1928年，哈佛医学院热带医学系主任安德鲁·沃森·塞拉兹（Andrew Watson Sellards）从达喀尔巴斯德研究所带回了含有法国黄热病毒株的恒河猴肝感染样本。

马克斯·泰勒（Max Theiler）被委托将此材料用于开发感染的小动物模型。

马克斯·泰勒（1899–1972）

泰勒出生于南非的比勒陀利亚，曾在伦敦圣托马斯医院接受医学培训。泰勒用具有感染性的达喀尔猴肝悬浮液在脑内接种成年的小鼠；所有动物均死于脑炎，无肝损害迹象。随后将这些小鼠的脑组织接种到恒河猴中，引起典型的致命黄热病，并伴有肝病。

小鼠模型的成功代表了黄热病研究的一个里程碑。

第六步 通过小动物连续传代，得到稳定的病毒

如果大家还记得，将近50年前，巴斯德（Pasteur）就曾经在疫苗研制过程中通过脊髓内或脑内途径感染了狗，猴，豚鼠和兔子的狂犬病。而泰勒就是沿袭了巴斯德的做法。

泰勒尝试通过小鼠脑内一系列连续传代来减毒黄热病病毒。他发现接种经过29和42次传代后接种小鼠脑物质的猴子在感染中幸存下来，没有临床症状，并且对强病毒的攻击具有抵抗力。

病毒在小鼠中的连续传代过程中其嗜神经性增加了，这表明连续传代病毒可能最终达到神经毒力的稳定阶段，即被“固定”，就像巴斯德将狂犬病毒在兔脑中连续传播后所发生的一样，其中固定病毒对犬的致病性较小。 

最终，泰勒在小鼠中传代法国毒株超过100代，产生了一种“固定”病毒，接种和动物死亡之间的间隔为4天。这项工作为疫苗奠定了基础。

黄热病的嗜神经性和嗜内脏性被认为具有独特的病毒特性。泰勒观察到，如果将黄热病病毒经脑内途径接种恒河猴后，猴子死于肝炎，而非脑炎。相反，通过小鼠脑内传代固定了嗜神经性的病毒，则已经丧失了在猴子中产生肝炎的能力。

泰勒的发现，加上受到黄热病健康威胁的患病人群众多，以及实验室研究人员接二连三感染黄热病的刺激，促使科学家们下定决心，要开发一种基于通过小鼠脑中连续传代的减毒活疫苗。

第七步 毒力减不够，免疫血清来补充

洛克菲勒研究小组的第一个黄热病疫苗是利用泰勒在小鼠中传代获得的“固定病毒”以及人类血清制造的。

这个的病毒株已经经小鼠大脑传代多达176次，而人类免疫血清则是为了保护人类免于减弱的病毒减毒不足而添加的。他们的方法非常细致，可以说是代表了当时活疫苗开发的最安全方法。

初步研究表明，疫苗和血清没有产生不良反应，并且产生了明确的免疫力。1931年，洛克菲勒大学的科学家在研究所的研究医院对住院病人进行了人类接种。没有观察到明显的不良反应。轻度不良事件包括局部压痛和充血，发烧和关节痛，是由于疫苗的脑组织成分引起的，而不是由黄热病病毒感染引起的。

随后，用小鼠脑病毒进行血清疫苗接种成为实验室工作人员免疫的标准方法，这些实验室工作人员感染黄热病的风险很高。到1934年，纽约，巴西，哥伦比亚和阿根廷已有56人接受了接种；伦敦惠康科学研究所进行了类似的研究。

但是，人体免疫血清的需求遇到了短缺的问题。尝试使用动物抗血清替代人血清的尝试引起了对反应原性、外来的动物病原体和成本的担忧。此外，在标准化条件和在疫苗制备中控制病毒-血清混合物的体外中和的技术的困难也是其广泛使用的主要障碍。

洛克菲勒小组认为这种嗜神经性病毒作为独立疫苗过于危险，因此采取了另一种方法，开始寻找致病性较低的病毒株，并寻求改进的疫苗制造方法。

第八步  如果不用免疫血清，难道就不行吗

哈佛大学的Sellards和突尼斯巴斯德研究所的Laigret于1932年率先使用不含免疫血清的法国病毒株接种人类，使用的是使用感染了经过传代134代的神经适应性法国病毒株的10％小鼠脑悬浮液。其中一些人出现了严重的副作用，包括恶心，呕吐，腹痛，活动过度，反射异常，咯血和蛋白尿。

Laigret认为，减毒不充分的嗜神经性病毒是造成这种情况的原因，因此他重新努力通过改变配方和降低剂量来开发一种更为安全的疫苗开发方案。

其中有一种方案是从巴斯德最初的狂犬病疫苗方法中借用的，就是先接种病毒在小鼠大脑中培养4天的“老病毒”，然后以20天的间隔分别再给予培养2天和1天的病毒。

还有一种方法是利用低温减毒，将病毒在20℃下“减毒”24小时并且使用蛋黄或者橄榄油包被。后者被认为可以减慢病毒从接种部位的扩散。

因此，在7年的时间里，尽管未经对照的临床试验，但嗜神经疫苗已从最初的人体试验过渡到大规模的试验。到1939年，西非已有20,000多人接受了上述两种疫苗接种方案之一。

随着更多人接种疫苗，最初对安全性和耐受性的担忧基本得以消除。但是，令人担忧的是尽管没有进行仔细的随访研究，但有中枢神经系统严重反应的报告出现。

第九步 换一种培养方法，换一种病毒毒株

索耶、泰勒和洛克菲勒基金会的其他科学家认为法国的疫苗嗜神经性风险太高，需要一种新的方法来减轻嗜神经病毒的危险。为此，泰勒及其同事利用了一种新开发的体外培养技术。

在1932年，泰勒证明了嗜神经性法国病毒也可以在鸡胚组织培养物中繁殖，但是尝试培育未经改变的原始法国病毒株却失败了。

于是，他们开始采用Asibi病毒株代替了法国病毒进行研究。

1936年，Asibi病毒株首次成功地进行了体外培养。经过240次传代后，尽管命名为17E的病毒在脑内接种后仍保留了产生脑炎的能力，但对恒河猴失去了嗜内脏性。

17E病毒被认为尚未充分减毒，残留的神经毒力使其仍然需要同时使用免疫血清，因此只是在实验室工作人员的血清免疫接种方案中替代了原有的嗜神经的病毒。

第十步 去除嗜神经性，17D疫苗得以问世

在初次繁殖时使用的切碎的整个小鼠胚胎中存在的神经组织负责维持培养的病毒的嗜神经性，促使泰勒在进行连续的病毒传代之前从培养基上除去大脑和脊髓组织。

最重要的实验传代病毒株-命名为17D-使用已在完整小鼠胚胎中传代培养18次的病毒，随后在完整切碎的鸡胚培养物中传代了58次，此后该病毒在去除了神经组织的切碎的鸡胚中传代。

通过小鼠的脑内接种测试了后一个子代的每一个的嗜神经性。休·史密斯（1902-1995）负责17D血统实验的监督。

休·史密斯不但协助泰勒开发了17D疫苗，还对其在巴西的临床研究和应用功不可没

在去除神经组织的雏鸡胚胎中连续传100次传代后（即开始体外培养后第176传代），史密斯观察到攻击的小鼠不再进展成致死性麻痹。在恒河猴中，该病毒的嗜内脏毒性也明显减弱，皮下接种后既不引起明显的病毒血症，也不引起肝炎。

进一步确定，在继代培养物第89和114代之间发生了猴子神经毒性的丧失，在第114和176代之间减弱了小鼠的神经毒性。

接种减毒病毒的猴子产生了中和抗体，并抵抗了野生型Asibi病毒的致死性攻击。体外和临床前数据表明，可以在不添加保护性免疫血清的情况下，将17D病毒作为人疫苗安全地进行测试。

第十一步  小规模临床研究：安全比有效更重要

遵循早期关于传染病研究的悠久传统，17D疫苗最初接种的两个人类受试者是泰勒和史密斯，他们都是低风险的人，因为他们都具有免疫力：泰勒是在1929年在哈佛期间因偶然的实验室感染而致病，而史密斯通过接种法国嗜神经病毒和免疫山羊血清获得免疫力。

在成功为另外两个免疫对象接种疫苗后，对五个非免疫个体给予了高剂量的减毒病毒。尽管出现了少量发热反应，但该产品耐受性良好，所有受试者的血清保护性中和抗体水平均升高。

泰勒和史密斯在黄热病疫苗研究中已达到关键的里程碑。

第十二步 大规模临床应用

在纽约进行的17D初步临床测试获得了令人满意的结果，随后它迅速转变为在黄热病威胁公众健康的国家-巴西使用。

在1937年1月到达里约热内卢的1个月内，史密斯开始了小规模的人体试验。他首次在24位未感染的对照工作者中证明了17D疫苗的耐受性和免疫原性，尽管在大约一半的受试者中记录了短暂病毒血症。

随后，他与Henrique de Azavedo Penna一起在当地的黄热病实验室建立了疫苗生产能力，并进行了额外的对照组免疫，并在6个月内扩大了疫苗的现场试验范围。

选定的疫苗评估地点位于巴西东南部Mineas Gerais州的Varginha，那里的咖啡种植园工人黄热病高发。到1937年8月，已有2,800多名受试者接种了疫苗，没有明显的不良反应。到年底，已有38,077人接种了17D疫苗。

该疫苗似乎是安全且具有免疫原性的，超过95％的受测受试者会产生中和抗体反应。在此期间，使用鸡蛋生产疫苗的方法得到了改进。在里约热内卢的奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会实验室扩大了生产规模，使用了17D疫苗来阻断疫情。

到1938年底，将近100万巴西人已经接种了17D疫苗。一年后，开始了本地生产相对便宜的疫苗的工作，包括疫苗，疫苗接种用具和现场使用所需的复杂冷链，估计每剂制造成本仅为当时的 10美分。

尽管从未以受控方式进行正式测试，但根据多年的经验，人们接受了17D黄热病疫苗的疗效。

非人类灵长类动物的大量临床前数据表明，它具有抗野生型病毒致死性攻击的保护活性。人17D免疫后，会迅速出现中和抗体，其中基于17D疫苗的中和抗体应答在美国接种疫苗的成年人中的有效率为99％，在秘鲁接种疫苗的婴儿中则超过95％。

流行病学观察同样证明了疫苗的有效性。黄热病的实验室感染在常规免疫之前很普遍，但此后消失。此外，超过50年的观察表明，南美国家的丛林黄热病仅发生在未免疫的人中，暴发期间的免疫应急接种可以使得病例迅速消失。

我国生产的黄热减毒活疫苗也是使用17D病毒株

黄热病17D疫苗长期以来被认为是最安全的活疫苗之一。神经性不良事件很少发生， 1960年终止对6个月以下婴儿的免疫接种后，安全性得到了进一步改善。

一种穿越了疫苗不同时代才得以成功开发的疫苗

1951年，洛克菲勒基金会的科学家马克斯·泰勒成为唯一因病毒疫苗的开发而获得诺贝尔生理学或医学奖的人。他的黄热病17D减毒活疫苗并不是第一个在人类中进行测试的黄热病疫苗，但它是迄今为止最成功的黄热病疫苗。自20世纪30年代后期问世以来，已经分发了超过5亿剂。

泰勒是历史上唯一一位因为成功开发病毒疫苗而获得诺奖的科学家

黄热病疫苗开发的故事之所以引人注目，部分原因是它跨越了疫苗历史的多个时代。

它的起源始于19世纪末，恰逢由微生物学和免疫学的启示驱动的疫苗接种概念迅速发展的时期。而疫苗真正成功的20世纪30年代，又处于病毒学出现的早期。在这个前分子时代，病毒基因型在不同宿主中传递时的基因型变化只能通过遵循生物学特性（如毒力）来间接研究。

尽管尝试重现导致17D内脏和神经嗜性减弱的传代过程，但泰勒无法解释原始传代89到176代之间发生的变化。通常，连续传代的病毒衰减导致生物学表型的变化非常不可预测。

17D疫苗开发的成功归因于系统、细致的应用经验以及有准备的头脑进行的敏锐而持续的观察。当然，成功也离不开幸运。

由于黄热病对医疗和公共卫生的影响，公众和科学界被迫采取潜在的预防措施，其中一些措施被证明无效或危险。

在此过程中，吸取了许多经验教训，这些经验教训已成为疫苗开发和评估常规的一部分：可控安全性评估的重要性；定量效能测定；热稳定性评估；生产过程中病毒传代的标准化和控制；神经毒性和内脏毒性的敏感标志物；控制病毒变异；以及监测罕见的不良事件。

新冠疫苗能够用减毒活疫苗技术开发吗？

包括黄热病17D疫苗在内，历史上有好几种非常成功的人类减毒活疫苗。它们都是基于实际病原体的减毒株，其毒力基因通过体外传代而丧失或突变。由于病毒在被接种的个体中复制，因此免疫应答很可能通过抗体和细胞免疫应答靶向结构性和非结构性病毒蛋白。

如果通过传统方法进行开发，就像黄热病17D那样，这将非常耗时，没有十几年的时间根本不可能获得成功。如果使用反向遗传学进行开发，比如通过合理修饰病毒（例如通过密码子去优化或删除功能基因）来实现衰减抵抗先天免疫识别，开发速度会快得多，但在技术上将具有挑战性。

同时需要特别指出的是，要产生一种用作疫苗的病原体减毒株，就需要证明其无法通过基因还原而变成病原体。在冠状病毒的情况下，这尤其具有挑战性。因为已知它们会在自然界中重组，并且从理论上讲，减毒的疫苗株可与野生型冠状病毒重组以重建致病株。

目前只有三种减毒活疫苗处于临床前开发阶段，所有这些都通过密码子去最优化而减毒。而最终能否获得成功，还需要我们耐心等待。

参考文献

Monath TP (2010) Yellow Fever In:Artenstein A(ed) Vaccines: A Biography. Springer, New York

Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines in development.  Nature 586, 516–527 (2020). 

Jeyanathan, M., Afkhami, S., Smaill, F. et al. Immunological considerations for COVID-19 vaccine strategies. Nat Rev Immunol 20, 615–632 (2020). 

http://en.wikipedia.org/wiki/Yellow_fever_vaccine