河南省郑州地区青铜时代遗址出土牛骨的DNA研究

扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR 阳性产物送到测序公司（Invitrogen）直接测序，正反引物双向测序。在全部实验过程中，严格按照防污染措施操作，具体实验操作详见。

　　4、数据分析

　　PCR 产物所得到的序列使用Chromas Pro 软件进行读取，通过Clustal X2 软件进行序列比对，并使用BioEdit 进行编辑。使用MEGA 6 软件构建系统发育树，对比序列包括：普通牛单倍型类群T1（Gen-Bank：JN817351和GenBank：MF475809）、普通牛单倍型类群T2 （GenBank：KT184456 和GenBank：MF475825 ）、普通牛单倍型类群T3 （GenBank：V00654 ）、普通牛单倍型类群T4 （GenBank：DQ124372）和瘤牛单倍型类群I（GenBank：EU177868和EU177870） ，水牛（GenBank：NC_006295 ）作为外类群，详见图一。

使用Network 5.0 软件构建中介网络图，选择中国考古遗址出土家养普通牛作为对比序列，包括：吉林后套木嘎、山西周家庄、山西陶寺、河南二里头、陕西石峁、陕西泉护村、辽宁大山前、青海长宁、新疆小河等，详见图二。

　　二、结果

　　在29 例牛骨样本中，本文成功地获得了14 个样本线粒体DNA 控制区的285bp 序列（16029～16313，去除两端引物），另有2 个样本（BOC82、BOC85）获得了部分线粒体DNA 控制区序列。

在GenBank 数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）对这些DNA 序列进行了BLAST 共享序列搜索，结果发现15 个样本属于家养普通牛（花地嘴遗址5 个、望京楼遗址10个），1 个样本（花地嘴遗址BOC82）属于水牛。

　　1、普通牛线粒体DNA 控制区序列变异情况及单倍型类群归属

　　以V00654作为参考序列， 将属于家养黄牛的15 个线粒体DNA 控制区序列与之进行比对，BOC85仅获得了部分线粒体DNA 序列（16029～16158，去除两端引物），实验结果见表二。共检测出10 个多态性位点，8 个为转换，1 个为颠换（16057G→C）， 另16302 位点既有转换（G→A）也有颠换（G→T），转换主要在嘧啶之间，占75.0%（6/8），遗传多态性不高。除BOC85 外， 其他14 个序列中共检测出8 个单倍型。

BOC64、BOC65、BOC73 和BOC79， BOC57、BOC71 和BOC83，BOC67 和BOC77 分别共享有相同的单倍型， 并且这三个单倍型在花地嘴遗址和望京楼遗址均有发现。

　　根据已发表研究成果关于普通牛单倍型类群的划分，基于线粒体DNA 控制区序列变异模式，本文发现的8 个单倍型可以归属于3 个不同的单倍型类群T2、T3 和T4， 以T3 为主占60.0%，T4 次之约占26.7%，T2 最少约占13.3%， 未见其他单倍型类群。以每个遗址为单位分别统计，比例相似。在花地嘴遗址中， 以T3 为主占60.0% ，T2 和T4 各占20.0%；在望京楼遗址中，以T3 为主占60.0%，T4 次之占30.0%，T2 最少占10.0%。

　　2、水牛线粒体DNA 控制区序列变异情况及单倍型类群归属

　　以NC_006295 和AY195595 作为参考序列，将属于水牛的BOC82 的线粒体DNA 控制区序列与之进行比对，并与康家水牛进行比较，实验结果见表三。根据已发表研究成果关于水牛单倍型类群的划分，基于线粒体DNA 控制区序列变异模式，本文发现的这1 例水牛的单倍型可以归属于单倍型类群KJ2，与康家遗址的5个个体、天马纱厂遗址的1个个体共享相同的线粒体DNA 控制区序列。

　　三、讨论

　　1、普通牛线粒体DNA 研究

　　二十世纪九十年代学术界开始在世界范围对现代家养黄牛进行遗传学研究， 以探讨其起源与驯化历史。综合这些关于线粒体DNA 控制区的分析，黄牛分为普通牛和瘤牛两个基因型； 普通牛有T、T1、T2、T3、T4、T5 和P、Q、R 等单倍型类群，其中T、T2和T3 主要分布于近东和欧洲，T1 主要发现于非洲，T4 仅见于东亚， 单倍型类群T5 发现于意大利黄牛种群中。由于T4 只存在于东亚，所以有学者认为东亚也是一个独立的普通牛驯化中心。

然而，最近研究显示T4 是单倍型类群T3 的一个分支。此外还有学者认为欧洲牛起源较为复杂，并非简单地近东引入，欧洲原牛对欧洲普通牛有基因贡献，例如普通牛中稀有的线粒体DNA 单倍型类群P、Q、R 等反映了家养普通牛和欧洲原牛之间存在杂交。