耐药细菌？噬菌体专治不服
中国科学院官方账号2020年6月，一名88岁的老爷爷由于严重的肺病住院治疗两年多时间，病情却不断恶化。老年人年龄大了本身免疫力就非常弱，再加上长期插管治疗反复机械通气，肺部发生了严重的细菌感染。并且，患者的肺部已经检测到了耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii， CRAB），一般的抗生素根本杀灭不了这种细菌。
还有其他办法吗？当然，噬菌体可以！
噬菌体，冲吧！
噬菌体是一种专门“感染”并杀死细菌的病毒，噬菌体只要遇到对的细菌就会钻进细菌体内大量繁殖，最后从内部把细菌“裂开”，释放出成百上千新的噬菌体。新释放出来的噬菌体再去感染细菌，产生下一代噬菌体，循环往复直到把所有的细菌斩尽杀绝。
左：噬菌体电镜照片，图中黑线为100 nm的标尺，足见噬菌体之小；右：噬菌体生活史（图片来源：论文作者供图与网络；https://www.researchgate.net/figure/Bacteriophage-lytic-life-cycle_fig1_343167119）
中国科学院深圳先进技术研究院马迎飞研究团队用噬菌体为患者治疗，随着治疗的进行，患者病情逐渐好转，肺部的耐药细菌也检测不到了，X光片下早已经苍白的肺部也逐渐转为了坚实的黑色。
X光下病人的肺部从肺炎症状的白色逐渐转化为健康的黑色（图片来源：论文作者供图）
噬菌体虽好，可还需改进
上面的故事并不是个例，长期患病的病人本身免疫力就十分低下难以抵挡各种细菌的入侵，加之频繁使用抗生素导致耐药细菌越来越多，非常容易出现患者被耐药细菌感染，医生束手无策，患者无药可医的局面。
面对耐药菌，噬菌体治疗往往是最后也是最有效的杀手锏。但是这样的杀手锏还可以改进，比如向噬菌体基因组内插入增加杀伤力的基因，让噬菌体更能大杀四方。但噬菌体的基因组本身非常小，基因组上还有很多没用的“冗余基因”，根本没空余位置插入“基因武器”。
这就好比，耐药细菌是敌人的堡垒，噬菌体是我方坦克要去炸碉堡。科学家想在坦克内部装上各种新式武器，结果打开车门往里一看：呦呵，车里满满当当装了移动餐吧、真皮沙发，可以养鱼遛鸟、喝酒泡茶，净是些没用的东西占着地方！
基因组里都是没用的基因，没办法插入新基因，这可不行啊。
连续删除系统：在不懂坦克的情况下拆坦克
马迎飞研究员设想，如果把噬菌体基因组上没用的基因删除，得到一个尽量精简的“底盘噬菌体”，这样就有足够的位置插入功能基因了，但是这面临三大挑战。第一个挑战是怎样高通量识别噬菌体的非必需基因，因为四分之三的噬菌体基因组找不到同源序列，使其不能通过信息分析进行非必需基因判断。第二个挑战是怎样筛选具有生长优势的突变噬菌体，有些噬菌体基因删除并不会使噬菌体“死亡”，但删除会严重影响噬菌体的扩增（准必需基因）。另外第三个挑战是逐删除基因组不同区域是费力和耗时的，特别是同时需要筛选能够维持稳健生长的突变噬菌体。
简单来说，科研人员只知道噬菌体的基因组序列却不知道基因组上哪些基因是无用的；即使知道了哪些基因是无用的，一个一个删除也非常慢；就算可以很快删除基因，每删除一个基因还要测试一次噬菌体的活力，用来评价哪种删除方案最好。如果真的按这样的方法一个一个基因删除再测试，猴年马月也得不到精简的“底盘噬菌体”。
精简噬菌体基因组的难度，大概相当于这个吧（图片来源：修改自网络）
近日，《核酸研究》（Nucleic Acids Research）发表了中国科学院深圳先进技术研究院马迎飞团队题为Genome-scale top-down strategy to generate viable genome-reduced phages的文章。该工作报道了一种高通量制备底盘噬菌体的方法，解决了上述3个难题，在噬菌体治疗和噬菌体合成生物学中具有巨大的潜在价值。深圳先进技术研究院马迎飞研究员为该文章的通讯作者，其博士生袁盛建为第一作者。
文章上线截图（文章链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkac1168）
接下来我们就详细解释下，这套系统是怎么解决三个难题的。
神奇的CiPGr
在细菌中，有一种对抗噬菌体的防御系统叫CRISPR。当噬菌体侵染含有CRISPR系统的细菌时，噬菌体的基因组会被切割掉。科研人员可以在细菌中人工设计一套CRISPR系统，当噬菌体进入这种细菌内部，某个特定的基因会有一定概率被删除。
正是基于CRISPR的原理，马老师团队开发了一种自上而下的全基因组简化方法，称为基于CRISPR-Cas9的迭代噬菌体基因组简化方法（CRISPR/Cas9-based iterative phage genome reduction, CiPGr）。
噬菌体基因连续删除示意图（来源：论文作者供图）
团队设计了5828 种特异的人工CRISPR系统，可以删除噬菌体上不同的基因。接下来把含有不同人工设计CRISPR系统的宿主菌混合在一起，并和噬菌体混合。
噬菌体会随机进入一个细菌，然后被删除一个基因。如果这个基因对噬菌体很重要，噬菌体会无法生存，再也没办法逃出细菌。如果被删除的基因无足轻重，那么噬菌体会在细菌内继续繁殖，释放出很多子代噬菌体，再进入下一个细菌，随机删除下一个基因。
实验流程设计的详细解释
诚然，噬菌体里面有很多倒霉蛋被删除了重要基因当场“死亡”。但是噬菌体数量非常多，小小一个试管中就有亿兆病毒，吞天沃日。这些病毒中总有一些幸运儿恰好只经过了那些删除无用基因的细菌，最终变成了精简版的“底盘噬菌体”。并且只有这些幸运儿可以不断增殖，因此最终得到的噬菌体中，越是能稳健增殖的噬菌体占比越高，刚好起到了筛选的效果。
三个难题被一次性解决，这大概就是演化思路暴力破解的神奇美感。
噬菌体基因连续删除示意图。灰色细菌会删除重要基因，蓝色细菌会删除不重要基因；左上角噬菌体被细菌一系列不重要基因而得到精简噬菌体，左下角基因被删除重要基因而无法产生后代。（来源：作者供图）
CiPGr让噬菌体更小了，但更强了
CiPGr系统被设计了出来，那么好使吗？好使，相当好使。
马迎飞团队使用CiPGr成功简化了四种不同的有尾噬菌体（T7、T4、seszw和selz）的基因组，发现四个不同噬菌体的基因有的从来不会被删除（必需基因，删除之后噬菌体无法生存），有的基因很少被删除（准必需基因，删除严重影响了噬菌体的扩增），还有的基因经常被删除（说明这些基因对噬菌体的增殖不是很重要）
这些被删除的基因中，越早被删除，说明该基因对噬菌体扩增就越不重要。经过不断删除，最终得到的最简底盘噬菌体删除了8-23%（3.3-35 kbp）的基因组。
之后对这些简化的噬菌体进行鉴定，发现部分突变株的抑菌或杀菌能力比简化之前强。实验团队把简化的噬菌体库与野生型宿主菌（注意是野生菌，没有CRISPR删除系统）混合在一起进行培养。经过8次连续转接后，具有较高侵染效率的突变噬菌体占比会越来越高，其中分离纯化出的部分简化基因组噬菌体比没有简化之前，杀死同样细菌的时间缩短一半以上，战斗力翻倍。
CiPGr：我既要又要还要
在CiPGr的操作过程中，有三个很重要的优点：
第一，只需要噬菌体的基因序列，不需要知道具体每个基因的作用。哪些基因重要哪些不重要，无所谓。反正做实验的噬菌体数量很多，反正删除重要基因的噬菌体都死掉了，活下来的噬菌体就是删除了非必须基因的噬菌体。这就可以让科学家轻松地对陌生的噬菌体也进行类似的“基因组精简”。毕竟得到噬菌体基因序列很容易而了解功能很难。
第二，研究陌生噬菌体时可以利用CiPGr系统对噬菌体进行精简，帮助科学家判断哪些基因重要，哪些不重要，更好地研究噬菌体。
第三，得到精简的“底盘噬菌体”，刚好能留下足够空间用于噬菌体改造，得到杀伤力更强的噬菌体用于临床或其他应用。
三个优点层层递进，既满足科学好奇心的探索，又一步步回到了我们刚开始的案例；既从生活中来，又到生活中去；既能致知，又能致用。这大概是世界上最完美的，既要又要还要。
参考文献：
1. Yuan S, Shi J, Jiang J,Ma Y. Genome-scale top-down reduction of phages to generate viable minimal phage genomes. Nucleic Acids Research; 2022, DOI: 10.1093/nar/gkac1168.
2. Tan X, Chen H, Zhang M, Zhao Y, Jiang Y, Liu X, Huang W,Ma Y. Clinical Experience of Personalized Phage Therapy Against Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Lung Infection in a Patient With Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Front Cell Infect Microbiol. 2021 Feb 26;11:631585. doi: 10.3389/fcimb.2021.631585. PMID: 33718279; PMCID: PMC7952606.
3. Peifen Chen,Ziqiang Liu, Xin Tan, Haijiang Wang, Yiyang Liang, Yingjun Kong, Wenxue Sun, Liqin Sun, Yingfei Ma, Hongzhou Lu. Bacteriophage therapy for empyema caused by carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. BioScience Trends; 2022, Volllume16, Issue 2, doi.org/10.5582/bst.2022.01147.
来源：中国科学院深圳先进技术研究院
