分子诊断(NGS)标准品构建

肿瘤个体化治疗以疾病靶点基因诊断信息为基础,以循证医学研究结果为依据,为患者提供接受正确治疗方案的依据,已经成为现代医学发展的趋势。临床研究证实,通过检测肿瘤患者Th物样本中Th物标志物的基因突变、基因SNP分型、基因及其蛋白表达状态来预测药物疗效和评价预后,指导临床个体化治疗,能够提高疗效,减轻不良反应,促进医疗资源的合理利用。

个体化医学检测应用技术包括Sanger测序法、焦磷酸测序法(Pyrosequencing)、新一代测序(NGS)、扩增阻滞突变系统(ARMS)-PCR法、高分辨率熔解曲线(HRM)法、数字PCR(DigitalPCR)、荧光原位杂交(FISH)、免疫组化(IHC)、荧光定量逆转录PCR(Q-RT-PCR)等。

NGS在分子诊断中的应用

(1)产前筛查和产前诊断:靶向区域基因组测序、大范围基因组测序、染色体非整倍性检测

(2)遗传病诊断

(3)肿瘤诊断与治疗

(4)植入前胚胎遗传学诊断

(5)病原微Th物检测

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什么是分子诊断的标准品

根据《体外诊断试剂注册管理办法》(试行),体外诊断试剂可分为I类、II类、III类,其中II类、III类要求进行性能验证,国内现有的个体户诊断项目绝大多数属于此类。

性能验证的内容包括:精密度或重复性(定性和定量)、准确度(定性为方法学比较或与标准样品盘比较)、线性(定量)、可报告范围(定量)、检出限(定性)、参考区间(定量)、抗干扰能力等。

涉及人基因组的检验项目包含如下质控品:

① 阴性质控品:判断假阳性反应

② 阳性质控品:判断假阴性反应

③ 提取内对照:监测提取效率是否符合要求

④ 扩增内对照:监测扩增效率是否符合要求

什么时候需要使用诊断标准品

· 免疫组织化学参考品

· 融合基因参考品(DNA层面、RNA层面、蛋白层面)

· 基因重排参考品(DNA层面、RNA层面、蛋白层面)

· 基因突变参考品(SNV、Indel)

· CNV参考品

· 低甲基化水平参考品

· 基因组不稳定参考品

NGS标准品构建的思考维度

(1)表征问题:标准品是否具有代表性,如何更具有代表性

(2)稳定性问题:是否满足批次内和批次间稳定性需求

(3)来源问题:获取途径的稳定性、可追溯性、可控性及可操作性

(4)成本问题:成本的可控性

NGS标准品的分类与特点

(1)原始材料来源:临床样品;原始细胞株

(2)基因修饰材料来源

(3)不同标准品模型之间的比较

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NGS标准品的模型构建

(1)随机修饰:VIRUS-FreeTM基因导入系统

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优势:流程短,无需病毒包装;插入片段大小不受限制;表型稳定

劣势:需要高效的转导方式

案例:人结直肠癌细胞HCT116/GFP稳转细胞株500转染24h 药筛3天后的荧光图片

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(2)定点修饰:基于CRISPR介导的基因编辑技术;适用于基因的定点缺失Del、定点插入Ins、定点突变SNV、拷贝数变异CNV和基因重排等。

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案例:293T细胞EGFR基因V769_D770insASV点突变

定点突变方案:通过CRISPR介导的同源重组技术进行定点突变p.V769_D770insASV (c. 2307_2308 ins GCCAGCGTG)

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 提升标准品模型质量的思路与策略

(1)混合克隆 → 单克隆

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(2)高代次细胞株 → 低代次细胞株

(3)病毒法 → VIRUS-FreeTM基因导入系统

(4)随机插入 → 定点修饰

(5)单独构建 → All in one

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