CRISPR筛选确定JUN为SHP2/ERK及RAS(ON)抑制剂的共性耐药靶点

胰腺癌是全球致死率最高的恶性肿瘤之一。在胰腺导管腺癌（PDAC）中，KRAS突变发生率超过85%，是推动肿瘤发生发展的核心驱动事件。围绕MAPK信号通路的联合靶向策略（如SHP2联合ERK抑制剂）已进入临床研究阶段，但获得性耐药仍是限制疗效提升的关键瓶颈。

荷兰癌症研究所的Rene Bernards与Sara Mainardi团队通过CRISPR全基因组敲除筛选结合系统功能验证，首次揭示在KRAS突变PDAC中，PI3K/AKT/mTOR通路激活与JUN高表达之间存在协同关联，共同介导对MAPK通路抑制的耐药机制。其中，JUN被确定为最下游的核心耐药执行因子。进一步研究表明，通过靶向MAP2K4抑制JUN活性能够显著逆转耐药表型。该研究为优化KRAS突变胰腺癌的联合治疗方案提供了新的理论依据与潜在干预靶点。

胰腺癌的总体5年生存率仅约10%，其高死亡率主要源于多数患者确诊时已属晚期以及有效治疗手段有限。传统化疗总体疗效不理想，而靶向治疗目前仅在少数存在同源重组缺陷的患者中显示获益。

KRAS是胰腺癌最关键的致癌驱动基因。由于其特殊的结构特征，KRAS一度被视为“不可成药”靶点。近年来，针对KRAS^G12C^突变的特异性抑制剂相继问世，并已获批用于非小细胞肺癌治疗。然而，在胰腺癌中最常见的KRAS^G12D^突变，其对应抑制剂仍处于早期临床研究阶段。

当前，围绕SHP2+ERK或RAS（ON）多选择性抑制剂的联合治疗策略虽已展开探索，但相关耐药机制尚不清晰。系统性解析介导耐药的关键分子与信号通路，已成为制定临床干预策略、提升治疗效果的迫切需求。

系统鉴定 KRAS 突变 PDAC 对 SHP2+ERK 抑制剂及 SHP2+RAS (ON) 多选择性抑制剂联合治疗的耐药介导因子，阐明其分子机制，验证靶向干预耐药通路的可行性，为 KRAS 突变胰腺癌的精准治疗提供新靶点和策略。

细胞模型构建：1.选取YAPC-1、ASPC-1、Panc

10.05、Panc-1及MiaPaCa-2等携带KRAS突变的PDAC细胞系，通过长期持续给予SHP2+ERK抑制剂（RMC-4550联合LY3214996）或SHP2+RAS（ON）抑制剂（RMC-4550联合RMC-6236）处理，成功建立MiaPaCa-2来源的自发获得性耐药细胞株（Resistant、Resistant_1）。

2.采用慢病毒介导的sgRNA转导建立PTEN基因敲除单克隆细胞系，同时通过慢病毒载体转导构建JUN稳定过表达细胞株；所有细胞系均经过STR分型鉴定及支原体检测确认，HEK293T细胞用于慢病毒的包装与制备。

全基因组CRISPR敲除筛选：在Panc
10.05细胞中导入Brunello全基因组sgRNA文库，经过嘌呤霉素筛选后，将细胞分为低剂量处理组（2 μM RMC-4550 + 2
μM LY3214996）、高剂量处理组（4 μM RMC-4550 + 4 μM
LY3214996）及未处理对照组。培养结束后回收细胞中的sgRNA并进行测序，利用DESeq2和MAGeCK
RRA方法对数据进行分析，以筛选与耐药相关的关键基因。

聚焦CRISPR筛选：针对初筛得到的167个基因设计定制化sgRNA文库，在四种KRAS突变的PDAC细胞系中进行高覆盖率（800×）筛选。随后利用STRING软件进行蛋白互作网络分析，从而锁定核心候选基因。

分子生物学实验： 利用WB、IHC验证通路激活状态和情况。

动物实验：将5×10⁶个Panc
10.05 PTEN敲除细胞接种于NSG小鼠右侧胁腹，建立异种移植瘤模型。待肿瘤体积达到200–250
mm³时，将小鼠分为溶剂对照组、HRX-0233单药组、SHP2+ERK抑制剂联合组以及三联用药组（SHP2+ERK抑制剂 +
HRX-0233）。通过灌胃给药，动态监测肿瘤体积变化，以评估体内靶向干预的疗效。

耐药介导因子筛选：采用两步CRISPR敲除策略（全基因组筛选+聚焦筛选），在KRAS突变的PDAC细胞中鉴定出PTEN、DET1、COP1等耐药相关基因。蛋白互作网络分析进一步确认PTEN为核心枢纽基因。

PTEN敲除耐药作用验证：通过构建PTEN敲除细胞系，证明其通过激活PI3K-AKT-mTOR通路介导对SHP2+ERK抑制剂的耐药。同时，自发获得耐药的细胞模型中也观察到该通路的激活，验证了该耐药机制的普遍性。

mTOR通路与JUN关联解析：在PTEN敲除及自发耐药细胞中观察到JUN高表达，结果表明mTOR通路的激活能够驱动JUN表达，并且JUN是mTOR下游的关键调控分子。

JUN作为核心耐药介导因子的验证：通过JUN过表达实验确认其能够独立介导耐药。同时，靶向抑制JNK/MAP2K4以下调JUN水平，可显著恢复细胞对SHP2+ERK抑制剂的敏感性。

体内验证耐药逆转策略：在PTEN敲除异种移植瘤模型中，结果显示MAP2K4抑制剂HRX-0233与SHP2+ERK抑制剂联合使用能够显著抑制肿瘤生长，有效逆转体内耐药。

JUN耐药介导作用拓展：研究表明，JUN同样在KRAS突变PDAC中介导对SHP2+RAS（ON）多选择性抑制剂联合治疗的耐药，进一步确认其为广谱耐药的核心调控节点。

主要结果

1.CRISPR基因筛选揭示KRAS突变PDAC对SHP2+ERK抑制耐药的关键中介因子

研究团队首先在Panc 10.05细胞中开展全基因组CRISPR筛选，以不同剂量的SHP2+ERK抑制剂组合作为选择压力，最终鉴定出多个耐药相关基因。低剂量与高剂量处理组共有的核心基因包括PTEN、PPP6C、PPP2R4等6个，而高剂量组由于筛选条件更严格，鉴定出的基因数量相对较少。

为进一步精细化分析，团队在四种KRAS突变PDAC细胞系中进行聚焦CRISPR筛选，结果显示耐药基因存在明显的细胞系特异性：MiaPaCa-2和ASPC-1细胞中共同富集的耐药基因为DET1和COP1，二者可组成E3泛素连接酶复合物，从而调控JUN蛋白的稳定性；Panc 10.05和Panc-1细胞则共享PTEN、CYB5R4等耐药基因。尽管PPP2R4在三种细胞系中均有富集，但单独验证其sgRNA后未显示耐药调控作用。随后通过STRING蛋白互作网络分析发现，PTEN是所有筛选得到耐药基因中的核心枢纽分子，从而成为后续机制研究的重点候选基因。

图1.CRISPR 基因筛选揭示了KRAS突变 PDAC 中对SHP2联合ERK抑制耐药的中介因子

2.PTEN敲除或PI3K-AKT-mTOR通路自发激活驱动对SHP2+ERK抑制剂的耐药

接着，研究团队发现在PTEN
敲除细胞系（Panc 10.05、Panc-1、ASPC-1）中，PI3K-AKT-mTOR 通路激活（p-AKT、p-S6RP 升高），对
SHP2+ERK 抑制剂的耐药性显著增加，且药物诱导的细胞凋亡被抑制。为进一步验证耐药机制的普遍性，研究构建了 MiaPaCa-2
自发耐药细胞系。结果显示，其未出现 MAPK 通路复激活（p-RSK 水平低），但 PTEN 表达降低、p-S6RP 升高，与 PTEN
敲除细胞具有相似的信号特征，且耐药细胞存在 “药物成瘾”
现象，撤药后增殖受抑。自发耐药细胞的单克隆株均保留耐药性，且均存在 PI3K-AKT-mTOR 通路激活；MiaPaCa-2 异种移植瘤经
SHP2+ERK 抑制剂处理后，p-S6RP 染色增强，证实体内治疗过程中 mTOR 通路激活参与获得性耐药。mTOR 抑制剂 AZD8055
可抑制耐药细胞增殖，与 SHP2+ERK
抑制剂联用可有效抑制亲本和耐药细胞的生长，但对部分细胞系（MiaPaCa-2、Panc-1）的耐药预防效果不完全，提示存在 mTOR
非依赖的耐药机制。

图2.PTEN 敲除或 PI3K-AKT-mTOR 通路自发激活介导对 SHP2+ERK 抑制剂的耐药

3.JUN 是 KRAS 突变 PDAC 中 MAPK 抑制耐药的最下游介导因子

团队进一步研究发现，在MiaPaCa-2自发耐药细胞克隆及PTEN敲除细胞中，总JUN及磷酸化JUN（p-JUN）水平显著升高，并且不受SHP2+ERK抑制剂影响；相比之下，亲本细胞中p-JUN水平会随药物处理下降。RNA-seq分析显示，PTEN敲除细胞的AP-1转录因子网络发生失衡，JUN显著上调，而抑制性AP-1成员BATF下调，提示AP-1活性偏向促增殖方向。

使用mTOR抑制剂AZD8055可同时下调mTOR靶标S6RP及JUN（总JUN和p-JUN）的表达，并且AZD8055与SHP2+ERK抑制剂联合处理可恢复PTEN敲除细胞对药物的敏感性。靶向抑制JUN上游分子（JNK抑制剂SP600125、MAP2K4抑制剂HRX-0233）可降低p-JUN水平，恢复PTEN敲除细胞对SHP2+ERK抑制剂的敏感性；相反，JUN过表达可直接赋予细胞耐药性，且不依赖于MAPK通路的再激活。

图3.JUN 是 KRAS 突变 PDAC 中 MAPK 抑制耐药的最下游介导因子

4.JUN 为体内耐药靶点，且介导对 SHP2+RAS (ON) 抑制剂的耐药

体内实验结果显示，Panc 10.05 PTEN敲除异种移植瘤对SHP2+ERK抑制剂表现出耐药，而联合使用MAP2K4抑制剂HRX-0233可显著抑制肿瘤生长，证明靶向JUN能够逆转体内耐药。SHP2抑制剂RMC-4550与RAS（ON）多选择性抑制剂RMC-6236在PDAC细胞系中显示出明显的协同抗瘤作用。

研究团队通过构建MiaPaCa-2自发耐药细胞系（Resistant_1）发现，该细胞系对药物的耐药表型相较于SHP2+ERK抑制剂耐药细胞更温和，且撤药后仍可持续增殖。Resistant_1细胞中PTEN表达下调，但mTOR通路未被激活，而p-JUN水平显著升高，提示JUN以mTOR非依赖方式介导对SHP2+RAS（ON）抑制剂的耐药。进一步实验表明，JUN过表达可直接赋予Panc 10.05及Panc-1细胞对SHP2+RAS（ON）抑制剂的耐药性，且不依赖MAPK通路复激活，从而确认JUN为广谱耐药的核心节点。

图4.JUN 为体内耐药靶点，且介导对 SHP2+RAS (ON) 抑制剂的耐药

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本研究通过全基因组CRISPR筛选结合体内外功能验证，系统解析了KRAS突变PDAC对MAPK抑制的耐药机制。结果表明，PTEN缺失引起的PI3K-AKT-mTOR通路激活及JUN高表达构成核心耐药机制，其中JUN是最下游的关键介导因子。同时，研究证实靶向MAP2K4抑制JUN能够有效逆转耐药，为优化KRAS突变胰腺癌的联合治疗策略提供了重要理论依据和潜在干预靶点。该发现不仅丰富了胰腺癌靶向治疗耐药的分子机制研究，也为临床开发更高效的联合治疗方案、改善患者预后奠定了基础。

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